張硯卓，李閃，吳成愛，陶劍鋒，王倩倩，于淑男，魏禎杰，姜旭

1 北京市創(chuàng)傷骨科研究所分子骨科研究室，北京100035；2 北京積水潭醫(yī)院矯形骨科

遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤（HME）又稱遺傳性多發(fā)性外生骨疣，是一種罕見的常染色體顯性遺傳的骨骼肌肉疾病，發(fā)病率約為1/50 000［1］。HME 的外顯率100%，主要特征是長骨干骺端外生多處軟骨骨疣，70%～90%的受累部位發(fā)生在股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端、腓骨和肱骨［2］，常伴有慢性疼痛、關(guān)節(jié)活動受限、肢體畸形、身材矮小、脊柱側(cè)凸和神經(jīng)血管異常等癥狀。2%的HME 患者骨軟骨瘤會發(fā)生惡化，轉(zhuǎn)變?yōu)楣前┗蚬侨饬觯?］。HME 具有遺傳異質(zhì)性，目前已報道3 個致病基因，分別為EXT1（MIM 608177）、EXT2（MIM 608210）和EXT3（MIM 600209）［4］。70%～95%的HME 患者由EXT1或EXT2基因突變導(dǎo)致，這兩同源基因編碼高爾基相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶，參與硫酸肝素生物合成［5-6］。HME 患者后代患病風(fēng)險高達(dá)50%，具有較高的遺傳性和致畸性，因此有必要進(jìn)行基因檢測或產(chǎn)前診斷［7］。2018年9月—2021年5月，我們收集一個中國漢族人HME 家系，對該家系中5例患者進(jìn)行致病突變鑒定，以明確其遺傳學(xué)病因，為家系的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 入選對象為2018 年就診于北京積水潭醫(yī)院的一個HME家系。先證者（Ⅲ3）出生時未見異常，因膝關(guān)節(jié)活動受限、疼痛2018 年到我院矯形骨科就診。經(jīng)X線檢查胸骨、肋骨、肩胛骨、股骨、脛腓骨、手指、腳趾頭等共有20 處軟骨瘤（圖1a～d）。對先證者家系成員進(jìn)行X線檢查，明確其父親、姐姐和姐姐的兩個孩子均患病。該HME 家系圖見圖2。先證者（Ⅲ3）自述其2歲時發(fā)病。他的父親Ⅱ2自述7歲時發(fā)病，在股骨、脛腓骨、手指、前臂、腳踝共有6處軟骨瘤（圖1e）。先證者的姐姐Ⅲ2，發(fā)病年齡1 歲，腳底板、手指、脛骨共有6 處軟骨瘤（圖1f）。先證者大外甥Ⅳ1，發(fā)病年齡7 個月，在肋骨、肩胛骨、前臂、手指、脛骨、腓骨、腳踝共有16 處軟骨瘤（圖1g）。先證者小外甥IV2，發(fā)病年齡7 個月，在肋骨、肱骨、股骨、脛腓骨、鎖骨、前臂、手指共有22 處軟骨瘤（圖1h）?；颊呤芾鄄课恢饕性诠晒呛兔劰?。所有患者因骨疣存在，使時?；顒邮芟蓿⑶一颊吒赣H和其倆外甥均有肢體畸形的表型，身高也較正常人偏矮。先證者（Ⅲ3）的母親（Ⅱ7）無任何多發(fā)性骨軟骨瘤的臨床表現(xiàn)，血液生化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)：先證者、先證者之父（Ⅱ3）、姐姐（Ⅲ2）和兩個外甥（Ⅳ1和Ⅳ2）血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平分別為1.05、1.09、1.07、1.07、1.08 mmol/L 低于正常值（1.16～1.42 mmol/L）。在取得家系成員的知情同意后，采集家系中5 名患者和II7 靜脈外周血4～5 mL。EDTA抗凝，置于4 ℃保存。本研究獲得北京積水潭醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，家系成員均簽署知情同意書。

圖1 HME家系X線影像圖

圖2 HME家系圖

1.2 HME家系致病突變基因鑒定

1.2.1 基因組DNA提取 采用QIAamp（Qiagen：貨號51104）血液基因組小量提取試劑盒提取外周血基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 全外顯子組測序 本研究的全外顯子組測序，委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。將基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成180～280 bp片段，經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA 文庫。帶有特異index 的文庫pooling后與生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢，合格即可進(jìn)行測序。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，隨后使用NGS3K/Caliper 對文庫的insert size 進(jìn)行檢測，insert size 符合預(yù)期后，使用qPCR 方法對文庫的有效濃度（3 nmol/L）進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格，運用Illumina HiSeq2500平臺進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過基本數(shù)據(jù)過濾（Base calling、過濾接頭序列、去污染），運用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）軟件比對至人類基因組參考序列GRCh37/hg19 上，經(jīng)ANNOVAR軟件對變異位點進(jìn)行注釋，篩選致病變異。應(yīng)用千人基因組數(shù)據(jù)（1000 g_all）、ExAC 數(shù)據(jù)庫、ESP6500數(shù)據(jù)庫（esp6500si_all）、gnomAD 數(shù)據(jù)（gnomAD_ALL和gnomAD_EAS）和dsSNP 等頻率數(shù)據(jù)庫，過濾掉頻率高于1%的突變。應(yīng)用預(yù)測軟件SIFT（http：//sift.jcvi.org/）、Polyphen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、PROVEAN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）、Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org）、M-CAP（http：//bejerano.stanford.edu/mcap/）和CADD（http：//cadd.gs.washington.edu/）對變異位點進(jìn)行致病性預(yù)測。同時使用數(shù)據(jù)庫ClinVar（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、OMIM（https：//omim.org）和HGMD（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）確定變異是否被收錄。根據(jù)2015年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南對變異致病性進(jìn)行分級。

1.2.4 PCR-Sanger 測序 從UCSC 人類基因組數(shù)據(jù)庫獲得EXT1（NM_000127.2）基因序列，使用在線引物設(shè)計軟件Primer5.0，針對候選變異設(shè)計特異性引 物（EXT1-E6-F：5’-ATACCATGGGAGAGACAGCA-3’和EXT1-E6-R：5’-GTAACGAGGCAGGATGAATG-3’），以家系成員基因組DNA 為模板，擴(kuò)增變異位點所在的EXT1基因的第六個外顯子。PCR反應(yīng)體系：正反向引物各0.75 μL（10 pmol/μL），La taq 聚合酶0.25 μL，2×GC buffer I 12.5 μL，無菌去離子水6.25 μL，DNA 模板100 ng；PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行36 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。測序產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司，采用ABI3730xl 測序儀進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)Codon-Code Aligner序列分析軟件分析。

2 結(jié)果

根據(jù)全外顯子組測序結(jié)果，用Sanger 測序?qū)ο茸C者和家人進(jìn)行突變驗證。結(jié)果表明：先證者EXT1基因第6 外顯子存在雜合突變c.1468dupC，該突變導(dǎo)致EXT1基因編碼的蛋白第490 位亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?，并在其后的?1 位形成終止密碼子（p.Leu490Profs*31，見圖3）；該突變可引起EXT1基因mRNA 的翻譯提前終止，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能缺失。家系中其他4例患者（Ⅱ3、Ⅲ2、Ⅳ1和Ⅳ2）均檢測到與先證者相同的突變（c.1468dupC），表型正常的家系成員未檢測到該位點的變異。家系驗證結(jié)果表明，家系內(nèi)存在基因型與表型共分離。多個同源序列比對分析表明，EXT1基因c.1468編碼的第490位亮氨酸在多種不同生物種屬內(nèi)均是保守的。

圖3 EXT1基因c.1468dupC變異位點Sanger測序結(jié)果

3 討論

HME 是一種遺傳異質(zhì)性的骨骼系統(tǒng)疾病，患病率為1/50 000，主要影響軟骨內(nèi)骨生長。外生骨疣的數(shù)量和大小不一，病變的位置也不同［8-9］。該疾病的特征是形成大量的軟骨帽和良性骨腫瘤（外生骨軟骨或骨軟骨瘤），通常伴有骨骼畸形和身材矮小。在少數(shù)患者中，外生軟骨會發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致骨肉瘤或軟骨肉瘤［10］。HME 患者膝關(guān)節(jié)畸形的發(fā)生率很高，約有1/3 的患者發(fā)展為膝外翻。30%～60%的HME患者中可見前臂弓狀畸形，患者其他骨骼畸形還包括肢體長度不一致、下肢外翻畸形和脊柱側(cè)凸。與女性患者相比，男性患者通常表現(xiàn)出更嚴(yán)重的癥狀，這可能是由于男性生長板閉合較晚，從而有更多的時間形成外生骨瘤造成的。此外，有較多外生骨的患者通常有較嚴(yán)重的殘疾和畸形［10］。該疾病沒有特異性藥物，只能在惡變的情況下手術(shù)切除癥狀最明顯、問題最嚴(yán)重的骨軟骨瘤［3］。70%～95%的HME 患者是由EXT1和EXT2突變所致，其中EXT1占56%～78%，EXT2占21%～44%［10］。EXT基因家族由腫瘤抑制基因組成，其功能的喪失或失調(diào)導(dǎo)致HME。EXT蛋白是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅱ型跨膜蛋白，包括一個N 端細(xì)胞質(zhì)尾部、一個跨膜結(jié)構(gòu)域、一個柄和一個大的球狀結(jié)構(gòu)域［11-13］。EXT1和EXT2在高爾基體中形成異寡聚糖基轉(zhuǎn)移酶，并與糖基轉(zhuǎn)移酶活性密切相關(guān)，通過交替添加GlcAc 和GlcNAc殘基延長HS鏈，參與硫酸肝素（HS）聚合［14］。EXT1/EXT2復(fù)合體比單獨的EXT1或EXT2具有更高的糖基轉(zhuǎn)移酶活性。由于HME 具有異質(zhì)性，且EXT1/EXT2基因片段較大，又缺少突變熱點，應(yīng)用WES 技術(shù)于HME患者突變鑒定［15］。

多發(fā)性骨軟骨瘤通常在兒童和青少年時期增加骨肉瘤的大小和數(shù)量。盡管它們對長骨的近骨骺端區(qū)有偏好，但事實上可以出現(xiàn)在身體的任何骨骼上，包括短骨、扁骨和不規(guī)則骨［12］。研究［16-18］表明，許多HME 患者在發(fā)病早期甚至后期都沒有任何臨床癥狀。在我院矯形骨科接診的患者中，一家系中三代出現(xiàn)患者，且全部自愿接受致病突變基因鑒定的情況并不常見。本研究所收集的家系中，所有患者因外生骨疣使活動受限，但軟骨未惡化成骨肉瘤或軟骨肉瘤，且患者未采用手術(shù)治療。家系中成年患者（Ⅱ2、Ⅲ2 和Ⅲ3）身高均低于正常人，且先證者父親（Ⅱ2）和他倆外甥（Ⅳ1 和Ⅳ2）均有四肢畸形。從患者的臨床表型、四肢畸形和骨疣數(shù)量，我們觀察到患者嚴(yán)重程度在家系中呈現(xiàn)出早現(xiàn)的現(xiàn)象。在患者血液生化檢測中發(fā)現(xiàn)，HDL-C 低于正常值。HDL-C 是體內(nèi)重要的脂蛋白，它的生物學(xué)功能主要體現(xiàn)在參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，改善血管內(nèi)皮功能，減少黏附因子表達(dá)，逆轉(zhuǎn)低密度脂蛋白氧化及抗凋亡等多個方面。研究發(fā)現(xiàn)HDL-C 水平與心血管病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)，血漿HDL-C 每上升0.026 mmol/L，心血管事件發(fā)生風(fēng)險可下降2%～3%。在血漿HDL-C組成及形成過程中最關(guān)鍵蛋白為apoA1和ABCA1［17］。在我們的研究中未發(fā)現(xiàn)apoA1 和ABCA1 的異常（含量及基因檢測）。至今，未見HME 與HDL-C 相關(guān)性研究報道。HME 導(dǎo)致血漿HDL-C 水平降低還是兩者互不相干而是由其他原因引起的HDL-C 水平降低，這些問題我們將進(jìn)一步進(jìn)行探究。

本研究我們通過全外顯子組測序?qū)σ粋€常染色體顯性遺傳的HME家系進(jìn)行致病突變分析，發(fā)現(xiàn)該家系是由EXT1基因第6 外顯子的一個移碼突變c.1468dupC（p.Leu490Profs*31）導(dǎo)致，該突變導(dǎo)致第490位后的編碼氨基酸發(fā)生移碼，并在第521位引入終止密碼，使EXT1基因編碼全長為746氨基酸組成的肽鏈縮短至由521 個氨基酸組成的截斷型蛋白。EXT1基因編碼硫酸肝素生物合成所需的糖基轉(zhuǎn)移酶。EXT1基因上的致病突變引起硫酸乙酰肝素聚合酶合成障礙或降解，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖成熟的信號被破壞，導(dǎo)致骨骺生長板發(fā)育異常，但其中的具體調(diào)控機(jī)制并不清楚［11-15］。迄今為止，數(shù)據(jù)庫Human Gene Mutation Database （HGMD，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/search.html）和Multiple Osteochondromas Mutation Database（MOdb，http：//medgen.ua.ac.be/LOVD）已報道數(shù)563 種EXT1和267種EXT2基因突變與HME 相關(guān)，隨機(jī)分布于各個外顯子區(qū)域［6］。大多數(shù)已知的致病變異會導(dǎo)致截斷蛋白的產(chǎn)生，如移碼突變、無義突變和剪接位點突變，錯義變異并不常見。檢索HGMD 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，本研究在一個中國人HME家系中發(fā)現(xiàn)的上述突變，曾在日本人群中被報道，再次證實了該突變的致病性［16］。

總之，我們在中國HME 家系中發(fā)現(xiàn)一個EXT1基因的突變，該結(jié)果進(jìn)一步擴(kuò)展了EXT1基因的突變譜，有利于后續(xù)的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，也為研究HME發(fā)病機(jī)制提供更多依據(jù)。