黎曉冬，武海燕，何潤(rùn)西，謝學(xué)軍，徐銘超

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病眼部的主要慢性致盲并發(fā)癥，當(dāng)前已成為我國(guó)重要的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。隨著研究的深入，DR不僅是單純的進(jìn)展性微血管病變，而且是一種視網(wǎng)膜神經(jīng)血管單元(神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞等)受損的多組織病變，以視網(wǎng)膜血管通透性增加、新生血管生成和神經(jīng)退行性改變?yōu)橹饕卣?，目前臨床應(yīng)用治療DR的靶點(diǎn)主要是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，對(duì)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及炎性細(xì)胞因子等新療法也在探索中[1]。臨床常用的視網(wǎng)膜激光光凝及抗VEGF等治療方式都有一定的局限性，且復(fù)發(fā)率高，因此從基因水平深入探究發(fā)病機(jī)制有利于進(jìn)一步提高DR的防治水平。MicroRNAs(miRNAs)調(diào)控著人類(lèi)大部分基因，參與人體各種疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)基于miRNAs靶基因和信號(hào)通路的研究表明miRNAs在DR發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控功能[2]，故本文將對(duì)miRNAs及其參與DR的發(fā)病機(jī)制和治療前景等相關(guān)研究予以綜述。

1 miRNAs概述

miRNAs是一類(lèi)由22～25個(gè)核苷酸組成的小分子單鏈非編碼RNA，第一個(gè)miRNA是1993年在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)中被首次發(fā)現(xiàn)的，是由lin-4基因產(chǎn)生的一種短RNA，其在轉(zhuǎn)錄后抑制lin-14 mRNA[3]，即miRNAs通常在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可下調(diào)或抑制靶向轉(zhuǎn)錄本的蛋白質(zhì)水平。目前研究發(fā)現(xiàn)miRNAs并非線(xiàn)蟲(chóng)獨(dú)有，它廣泛存在于不同的動(dòng)植物中[4]；在miRNAs儲(chǔ)存數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase中列出了人類(lèi)含有的1917個(gè)前體miRNAs(pre-miRNAs)和2654個(gè)成熟miRNAs[5]，超過(guò)60%的人類(lèi)蛋白質(zhì)編碼基因含有預(yù)測(cè)的miRNAs靶點(diǎn)[6]，一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)一個(gè)甚至幾百個(gè)基因，而多個(gè)miRNAs也可以只調(diào)節(jié)一個(gè)基因。多項(xiàng)動(dòng)物研究證實(shí)生成miRNAs的兩種關(guān)鍵酶Dicer1、Drosha以及DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)基因8(DiGeorge syndrome key region gene 8，DGCR8)的缺失導(dǎo)致動(dòng)物模型表現(xiàn)出胚胎致死性，這表明miRNAs在哺乳動(dòng)物發(fā)育、細(xì)胞分化和動(dòng)態(tài)平衡中極其重要[7-8]。

1.1miRNAs的產(chǎn)生和作用機(jī)制miRNAs的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，主要通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ、轉(zhuǎn)錄因子和RNA結(jié)合蛋白在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄成發(fā)夾樣的原始miRNAs(pri-miRNAs)，隨后由DGCR8和內(nèi)切酶Drosha組成的復(fù)合體特異性切割pri-miRNAs，得到約70個(gè)核苷酸組成的pre-miRNAs，同時(shí)輸出蛋白5又將pre-miRNAs從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步加工，由發(fā)夾酶Disher切割pre-miRNAs末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)樣環(huán)后產(chǎn)生兩條miRNA雙鏈；RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物與miRNAs雙鏈中的一條形成miRNAs誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(miRNA-induced silencing complex，miRISC)，另外一條miRNAs鏈則被舍棄；miRISC中的關(guān)鍵蛋白阿爾古2蛋白(argonaute 2 protein，AGO2)攜帶成熟的miRNAs識(shí)別位于靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)的互補(bǔ)序列，并促進(jìn)mRNA的翻譯抑制或降解[9-10]。

1.2miRNAs的功能miRNAs調(diào)控基因表達(dá)的功能決定細(xì)胞發(fā)育、增殖分化、死亡以及糖脂代謝等重要進(jìn)程，具有廣泛性和多樣性。最初學(xué)者們認(rèn)為miRNAs只在產(chǎn)生miRNAs的細(xì)胞中調(diào)節(jié)其靶mRNA的表達(dá)。然而，最新研究發(fā)現(xiàn)miRNAs也可以從細(xì)胞分泌到循環(huán)系統(tǒng)影響全身各個(gè)靶器官[11]，那么血清或體液中miRNAs則有望成為早期診斷各種代謝性疾病的生物標(biāo)記物和潛在治療靶點(diǎn)，如肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等[12]。另有研究表明分泌的miRNAs，尤其是細(xì)胞外囊泡中分泌的miRNAs，如外泌體，可以介導(dǎo)不同組織之間的旁分泌和內(nèi)分泌信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和遠(yuǎn)端細(xì)胞功能[13]。

2 miRNAs與視網(wǎng)膜疾病的相關(guān)研究

miRNAs在視網(wǎng)膜正常發(fā)育、結(jié)構(gòu)及功能中起著重要作用[14]。Karali等[15]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析人類(lèi)視網(wǎng)膜中miRNAs表達(dá)，研究數(shù)據(jù)顯示幾乎1/5已知人類(lèi)miRNAs在神經(jīng)視網(wǎng)膜中表達(dá)，如miR-182-5p、miR-183-5p、miR-96-5p、miR-124-3p、miR-9-5p。在視網(wǎng)膜表達(dá)的miRNAs中，90%以上存在同分異構(gòu)體，已有研究證明，人類(lèi)miR-204種子區(qū)修飾的異構(gòu)體雜合突變是導(dǎo)致視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良和雙眼缺損的常染色體顯性遺傳病的原因[16]。這些在視網(wǎng)膜中特異性高表達(dá)的miRNAs不僅在維系視網(wǎng)膜功能方面具有重要的作用，且與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸也有密切聯(lián)系。

3 miRNAs與DR的相關(guān)研究

目前研究較多的與氧化應(yīng)激、炎癥及VEGF等相關(guān)且在DR發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用的miRNAs見(jiàn)表1。

表1 DR相關(guān)的miRNAs

3.1miRNAs與氧化應(yīng)激和炎癥氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是參與DR的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制，高血糖誘導(dǎo)的晚期糖基化終末產(chǎn)物/受體、多元醇途徑、蛋白激酶C激活和氨基己糖途徑的增加，產(chǎn)生氧化應(yīng)激、活性氧(ROS)積聚及細(xì)胞凋亡，促進(jìn)促炎介質(zhì)和趨化因子產(chǎn)生，誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性改變，并導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障破壞、血管通透性增加及新生血管生成，加重DR神經(jīng)血管功能障礙[17]。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-455-5p通過(guò)下調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的表達(dá)減少高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞內(nèi)ROS、丙二醛以及NADPH氧化酶的含量，并抑制炎性因子白介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)釋放；此外，增強(qiáng)miR-455-5p的表達(dá)能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，降低Bcl-2凋亡蛋白的表達(dá)，表明miR-455-5p是通過(guò)靶向SOCS3抑制細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而減輕RPE細(xì)胞的損傷，因此miR-455-5p可能成為治療DR新的靶點(diǎn)。近期研究顯示，miR-144-3p的過(guò)表達(dá)能通過(guò)下調(diào)核因子紅系相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)及其抗氧化靶基因的表達(dá)加劇RPE細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而miR-144-3p抑制劑可保護(hù)動(dòng)物模型RPE的完整性和功能，增強(qiáng)抗氧化基因的表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激，故miR-144-3p也具有延緩DR病程進(jìn)展的作用[19]。

去乙酰化酶1(sirtuin 1，SIRT1)是miRNA-195的靶基因，具有抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用，Mortuza等[20]發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal endothelial cells，HRECs)中的miRNA-195與SIRT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制miRNA-195可以上調(diào)SIRT1的表達(dá)，從而促進(jìn)抗氧化和抗炎作用，抑制HRECs凋亡，緩解DR微血管損傷。

3.2miRNAs與VEGF 高血糖導(dǎo)致缺氧引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常和VEGF表達(dá)增加，VEGF誘導(dǎo)血管通透性增加以及新生血管生成是DR微血管病變的重要代償反應(yīng)[21]。同時(shí)，VEGF的表達(dá)水平也能反映早期DR的病情進(jìn)展。

近年來(lái)已有研究證明miRNAs通過(guò)靶向3’UTR控制VEGF的表達(dá)影響DR發(fā)病，如增強(qiáng)miR-152的表達(dá)則直接作用于腎素受體3’UTR，下調(diào)腎素受體表達(dá)水平并調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，降低高糖條件下HRECs中VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VRGFR-2)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)[22]，改善DR微血管病變。Yang等[23]利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)VEGF作為miR-15b的靶基因，miR-15b能下調(diào)VEGF的表達(dá)，RNA測(cè)序技術(shù)等發(fā)現(xiàn)增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者的血液中循環(huán)miR-15b與VEGF直接相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)用miR-15b模擬物轉(zhuǎn)染HRECs進(jìn)一步證實(shí)miR-15b通過(guò)直接靶向VEGF的3’UTR區(qū)域調(diào)控VEGF轉(zhuǎn)錄，相反，在培養(yǎng)中過(guò)表達(dá)miR-15b可抑制VEGF的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系；隨后發(fā)現(xiàn)通過(guò)在糖尿病Goto-Kakizaki(GK)大鼠玻璃體內(nèi)注射miR-15b又可以改善DR的病理指標(biāo)，如微血管密度、血管迂曲、微動(dòng)脈瘤、毛細(xì)血管無(wú)灌注和熒光素滲漏等。促血管生成因子VEGF-A通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活、遷移和增殖增強(qiáng)血管通透性[24]，與DR發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。與正常人相比，DR患者miR-200b表達(dá)降低，VEGF-A表達(dá)增加，且miR-200b可能通過(guò)下調(diào)靶基因VEGF-A mRNA的表達(dá)[25]延緩DR發(fā)生，因此miR-200b可能是治療DR的一種有前景的靶點(diǎn)。

缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是促進(jìn)缺氧適應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，參與視網(wǎng)膜組織新陳代謝、應(yīng)激和對(duì)低氧條件的適應(yīng)，在多種缺血性和炎癥性視網(wǎng)膜疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是在DR中HIF會(huì)增加VEGF和其他缺氧調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的表達(dá)；VEGF的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血管通透性增加、新生血管形成，并且會(huì)促進(jìn)視網(wǎng)膜血管的閉合，從而形成無(wú)灌注區(qū)加劇缺血缺氧并產(chǎn)生惡性循環(huán)[26-27]。既往研究顯示，在缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-424表達(dá)增加并調(diào)節(jié)HIF-1α促進(jìn)病理血管生成[28]。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor，PEDF)與VEGF的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于DR病理血管生成十分關(guān)鍵，Wu等[29]研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p直接抑制HIF mRNA轉(zhuǎn)錄從而減少VEGF表達(dá)，VEGF成為miR-199a-3p潛在靶點(diǎn)，PEDF是miR-363的潛在靶點(diǎn)，且miR-363在DR中表達(dá)增加，而miR-199a-3p表達(dá)下調(diào)，這表明miR-199a-3p和miR-363可能分別在DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中調(diào)節(jié)VEGF和PEDF的表達(dá)。近期研究發(fā)現(xiàn)，在DR患者的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-150-5p降低和miR-21-3p、miR-30b-5p、HIF-1α升高可能共同導(dǎo)致異常血管生成，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[30]。

3.3其它己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)是葡萄糖代謝的關(guān)鍵因子，既往研究報(bào)道肝癌中上調(diào)的HK2可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，也是miR-384-3p的靶基因[31]，血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成[32]。近期研究發(fā)現(xiàn)DR小鼠中HK2、PECAM-1呈高水平表達(dá)，miR-384-3p是低表達(dá)狀態(tài)，研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)miR-384-3p過(guò)表達(dá)通過(guò)下調(diào)HK2的表達(dá)抑制DR小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-384-3p模擬物可降低HK2的表達(dá)，達(dá)到減少細(xì)胞增殖和視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成的目的[33]。

酸性鞘磷脂酶(ASM)是一種將鞘磷脂轉(zhuǎn)化為促炎和促凋亡的神經(jīng)酰胺酶，與其他視網(wǎng)膜細(xì)胞相比，糖尿病患者視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中ASM的激活程度最高，內(nèi)皮細(xì)胞是ASM的主要來(lái)源[34]。Wang等[35]對(duì)DR患者HRECs中差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行陣列整理分析后確定miR-15a可能是一種同時(shí)抑制ASM和VEGF-A激活的miRNA，體外研究表明miR-15a通過(guò)直接靶向ASM mRNA的3’UTR負(fù)向調(diào)節(jié)ASM的表達(dá)，且此研究中DR小鼠miR-15a的表達(dá)降低直接導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)ASM活化、VEGF-A及促炎因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加、細(xì)胞凋亡及血管生成。因此，miR-15a是針對(duì)DR抗炎和抗血管生成的雙重靶點(diǎn)。

骨橋蛋白介導(dǎo)HRECs細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)合成異常，從而導(dǎo)致基底膜增厚是早期DR最顯著的特征，近期研究報(bào)道m(xù)iR-29a是一種顯著的針對(duì)和直接下調(diào)Col Ⅳ表達(dá)的miRNA，表明骨橋蛋白可能是通過(guò)抑制miR-29a途徑上調(diào)HRECs中Col Ⅳ的表達(dá)參與DR發(fā)病機(jī)制[36]。

4 DR相關(guān)的循環(huán)miRNAs生物標(biāo)記物

當(dāng)細(xì)胞中miRNAs被動(dòng)或通過(guò)微囊泡主動(dòng)釋放到血液或體液循環(huán)中，約有2wk的時(shí)間保持活性，它們?cè)谘獫{、血清及尿液中凍融時(shí)的穩(wěn)定性、高效回收和定量檢測(cè)的有效性是成為生物標(biāo)志物的可靠條件，也是一種潛在的生理和病理過(guò)程介體[37]。Zampetaki等[38]對(duì)300份1型糖尿病患者血清中的29個(gè)miRNAs進(jìn)行定量對(duì)照，數(shù)據(jù)顯示miR-27b和miR-320a顯著且獨(dú)立地與高DR風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析證明miR-27b和miR-320a均以抗血管生成蛋白——血栓反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)為共同靶標(biāo)調(diào)節(jié)血管生成，因此miR-320a和miR-27b可以成為診治DR的潛在生物標(biāo)志物。另一項(xiàng)關(guān)于1型糖尿病患者血清樣本的大型前瞻性研究顯示miR-126水平與糖尿病血管并發(fā)癥尤其是PDR密切相關(guān)[39]。Ji等[40]通過(guò)驗(yàn)證分析DR患者血清中miRNAs發(fā)現(xiàn)，miR-3197和miR-2116-5p均有望成為診斷DR的生物標(biāo)志物，但它們?cè)贒R發(fā)病中的分子機(jī)制仍不清楚。DR患者血漿中miRNAs的表達(dá)差異也很明顯，近期臨床研究表明miR-320a[41]、miR-328-3p[42]、miR-29c-3p[43]、miR-29和miR-200b[44]等均可作為DR 的新型生物標(biāo)志物。因此，研究DR相關(guān)的循環(huán)miRNAs生物標(biāo)志物可有助于指導(dǎo)臨床表型的分類(lèi)、診療隨訪(fǎng)方案的確立以及預(yù)后評(píng)價(jià)。

5小結(jié)與展望

DR作為一種可防性致盲性眼病，其關(guān)鍵在于早期預(yù)防，早發(fā)現(xiàn)、早診治，因此，深入系統(tǒng)地研究DR發(fā)生的病理生理機(jī)制及其生物標(biāo)志物是十分有必要的。miRNAs是一類(lèi)新型的基因表達(dá)調(diào)控因子，它們不僅在DR的病因和病理中的作用已逐步被證明，并且與多種眼科疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[45]。miRNAs通過(guò)調(diào)控以VEGF為代表的各種關(guān)鍵因子進(jìn)而調(diào)節(jié)DR發(fā)生發(fā)展過(guò)程中不同的病理變化，包括細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)、微循環(huán)損傷、氧化應(yīng)激等，但miRNAs調(diào)控DR的確切分子機(jī)制及參與的關(guān)鍵信號(hào)通路等非常復(fù)雜，仍需要深入研究。因此，miRNAs拮抗劑或類(lèi)似物作為一類(lèi)新的藥物可能有助于阻止或減緩DR病變的發(fā)生和發(fā)展。目前研究表明miRNAs具備易于檢測(cè)、可預(yù)測(cè)DR進(jìn)展病理機(jī)制及提供高效治療干預(yù)手段等特點(diǎn)，是一種理想的有前景的生物標(biāo)志物，但是其無(wú)法預(yù)測(cè)DR病情嚴(yán)重程度，也不能區(qū)分DR的分期階段，目前針對(duì)DR患者的特異性與敏感性高的miRNAs改變還需要大量的臨床病例研究，才能提高其臨床應(yīng)用價(jià)值，成為早期干預(yù)DR的有力依據(jù)與治療方法，并且基于miRNAs配合抗炎、抗氧化等個(gè)性化聯(lián)合治療將有助于提高DR患者視覺(jué)質(zhì)量和生活質(zhì)量。