鐘麗紅， 丘創(chuàng)華， 彭紫元， 佘吉佳

（1.深圳市第二人民醫(yī)院干部保健科，廣東 深圳 518000；2. 深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518000）

目前，2型糖尿病的患病率持續(xù)升高。食用富含飽和游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）是導致肥胖和2型糖尿病的主要環(huán)境因素之一。為了維持正常的血糖水平，肥胖者對胰腺β細胞產(chǎn)生胰島素的需求很高，導致β細胞功能和存活受到不利影響。β細胞的再生潛力相對較低，受到損傷后可能會對葡萄糖穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生不利影響[1]。長期暴露于飽和FFA會引起β細胞中凋亡蛋白與生存蛋白之間的失衡，從而導致細胞凋亡并可能導致2型糖尿病。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitinproteasome system，UPS）是生理未折疊蛋白反應的一部分，可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。有研究結(jié)果顯示，2型糖尿病患者胰島中的泛素化蛋白（ubiquitinated protein，Ub）水平顯著升高，高水平的蛋白質(zhì)泛素化與β細胞凋亡有關(guān)[2]，而蛋白質(zhì)泛素化增加和β細胞凋亡是否是UPS失活的繼發(fā)因素仍未知。本研究通過分析FFA引起的UPS失活是否構(gòu)成β細胞凋亡的上游信號通路，探討脂毒性應激對B淋巴細胞瘤（B-cell lymphoma，Bcl）-2蛋白誘導胰島β細胞凋亡的調(diào)節(jié)機制。

1 材料和方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)

將12只C57BL/6（野生型）小鼠飼養(yǎng)于37 ℃ 12 h明暗循環(huán)的房間中，可以自由獲取食物和水。以6只C57BL/6小鼠構(gòu)建PUMA-/-小鼠。給小鼠喂食高脂肪飲食（澳大利亞Specialty Feeds公司）72 h，營養(yǎng)成分為17.6%（W/W）蛋白質(zhì)、27%（W/W）脂肪，脂肪成分為14.59%的飽和脂肪、11.66%的單不飽和脂肪和0.53%的多不飽和脂肪。

1.2 小鼠胰島細胞和小鼠胰島瘤MIN6細胞培養(yǎng)

采用膠原酶P（瑞士R o c h e公司）和Histopaque-1077密度梯度分離液（美國Sigma公司）分離小鼠胰島β細胞。PUMA-/-小鼠胰島經(jīng)過洗滌，手工挑選，使用CMRL培養(yǎng)基1066[美國Invitrogen公司，含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；美國JRH Biosciences公司）]在37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。MIN6細胞購自美國ThermoFisher Scientific公司，使用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司，含10%FBS）在37 ℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。

1.3 實驗分組

1.3.1 處理組 分別用棕櫚酸酯（美國Sigma公司）、蛋白酶體抑制劑MG132（美國Sigma公司）處理MIN6細胞0（即刻）、2、4、8、24 h，檢測細胞蛋白酶體活性和細胞活性，采用實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測活化轉(zhuǎn)錄因子（activated transcription factor，ATF）4 mRNA、重鏈結(jié)合蛋白（heavy-chain binding protein，Bip）mRNA、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，Chop）mRNA、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）mRNA表達量，采用免疫印跡法檢測Bcl-2、Bcl-XL、髓細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱Akt）蛋白表達量。用蘿卜硫烷（sulforaphan，SFN）、棕櫚酸酯、SFN+棕櫚酸酯分別處理小鼠胰島β細胞0（即刻）、2、4、8、24 h，檢測ATF 4 mRNA、Bip mRNA、Chop mRNA、PUMA mRNA和Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Akt表達以及細胞活性。具體處理方法：采用含1%FBS和1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的DMEM培養(yǎng)小鼠胰島細胞和MIN6細胞。將棕櫚酸酯溶于90%乙醇中，終濃度為0.5 mmol/L（含1%BSA），使未結(jié)合的FFA濃度在nmol/L級別[3]。將蛋白酶體抑制劑MG132和抗氧化劑SFN溶解在二甲基亞砜（美國Sigma公司）中，MG132和SFN的使用濃度均為10 μmol/L，均在培養(yǎng)基加入棕櫚酸酯前2 h加入。

1.3.2 對照組 按相同步驟培養(yǎng)和處理小鼠胰島細胞和MIN6細胞，但不加入MG132和SFN，僅加入等體積的二甲基亞砜溶劑。

1.4 蛋白酶體活性檢測

用10 μmol/L FFA或10 μmol/L棕櫚酸酯處理后，再使用含0.5% NonidetP-40的磷酸鹽緩沖液制備MIN6細胞裂解物，4 ℃ 10 000×g離心10 min，以清除細胞核和未裂解的細胞碎片。采用蛋白酶體活性測定試劑盒（美國BioVision公司，貨號K245-100）測定澄清的裂解物中的蛋白酶體活性。將7-氨基-4-甲基香豆素標準品、陽性對照和不同處理方式得到的MIN6細胞裂解樣本一式兩份裝入96孔板中，采用EnSpire多模式讀板器（美國Perkin Elmer公司）（激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長445 nm）在60 min內(nèi)平行測定樣本的蛋白酶體活性。嚴格按試劑盒和儀器說明書操作。

1.5 實時定量PCR

使用NucleoSpin RNA XS（德國 Macherey-Nagel公司）制備小鼠胰島細胞和MIN6細胞的RNA。使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司）將600 ng RNA制備First strand cDNA。將制備的cDNA用去離子水1∶20稀釋。采用實時熒光定量PCR檢測ATF4 mRNA、Bip mRNA、PUMA mRNA和Chop mRNA表達量。TaqMan PCR Master Mix試劑盒購自美國ABI公司，檢測儀器為RotorGene RG-3000熒光定量PCR儀（德國 Qiagen公司）。反應體系：總體積為20 μL，包括SYBR mix 10 μL、H2O 5 μL、引物4 μL、Template 1 μL。反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，42個循環(huán)；58 ～ 95 ℃收集熒光，通過熔解曲線評估PCR的特異性。收集目的基因Cq值，計算ΔCt值，分別與內(nèi)參基因β-actin的ΔCt值比較，得到-ΔΔCt值。

1.6 免疫印跡法

MIN6細胞培養(yǎng)和處理后，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解總蛋白。12 000×g離心5 min后，用蛋白質(zhì)檢測試劑盒（美國伯樂公司）檢測蛋白質(zhì)濃度。用等量的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene floride，PVDF）膜上，4 ℃與一抗孵育過夜。一抗（美國ThermoFisher Scientific公司）分別為抗Bcl-2抗體（1∶1 000）、抗Bcl-XL抗體（1∶1 000）、抗Mcl-1抗體（1∶1 000）、抗Chop抗體（1∶1 000）、抗Akt抗體（1∶1 000）、抗Ub抗體（1∶1 000）。將PVDF膜與二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體，美國ThermoFisher Scientific公司）孵育2 h。最后使用增強化學發(fā)光檢測試劑盒（南京諾維贊公司）檢測印跡，以β-actin為參照，分析Bcl-2、Mcl-1、Akt、Bcl-XL、Chop和Ub蛋白的表達量。

1.7 細胞活性評估

用胰蛋白酶將小鼠胰島β細胞和MIN6細胞分散成單個細胞，采用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色分析DNA片段。采用DNA染料Hoechst-33342（含10 μg/mL Hoechst-33342）和PI（5 μg/mL）染色后，在BM-38XD型倒置熒光顯微鏡（上海彼愛姆公司）下觀察至少600個細胞，計算小鼠胰島β細胞和MIN6細胞凋亡的百分比。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad prism 6 軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，組間比較采用配對t檢驗或ANOVA分析，然后進行Bonferroni校正。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組MIN6細胞Ub水平、蛋白酶體活性和細胞活性比較

棕櫚酸酯組和FFA組的Ub水平分別為1.42±0.11、1.37±0.12，顯著高于對照組（1.01±0.03）（P＜0.05）。

與處理0 h比較，采用棕櫚酸酯處理MIN6細胞不同時間的蛋白酶體活性下降，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；采用MG132處理MIN6細胞8 h的蛋白酶體活性顯著降低（P＜0.05）；MG132處理MIN6細胞24 h的Ub水平顯著升高（P＜0.05）。棕櫚酸酯組和MG132組處理24 h后，MIN6細胞凋亡數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同處理組MIN6細胞Ub水平的比較及細胞凋亡情況

2.2 不同處理組MIN6細胞凋亡和凋亡相關(guān)基因、蛋白表達量的比較

與0 h比較，棕櫚酸酯和MG132處理24 h后MIN6細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物ATF4 mRNA、Bip mRNA和Chop mRNA的表達量顯著升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同處理組MIN6細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因和蛋白的表達量比較

與0 h比較，棕櫚酸酯和MG132處理24 h后MIN6細胞Bcl-2、Bcl-XL蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。Mcl-1蛋白表達量呈先升后降趨勢，棕櫚酸酯處理2 h時Mcl-1蛋白表達量最高，顯著高于0 h（P＜0.05），處理24 h時顯著低于0 h（P＜0.05）；MG132處理2 h時Mcl-1表達量顯著高于0 h（P＜0.05），處理8 h時Mcl-1蛋白表達量最高，但處理24 h時Mcl-1蛋白表達量仍顯著高于0 h（P＜0.05）。見圖3。

圖3 不同處理組MIN6細胞凋亡相關(guān)蛋白表達量的比較

與0 h比較，棕櫚酸酯和MG132處理24 h后MIN6細胞的Akt蛋白表達量均顯著下降（P＜0.05），PUMA mRNA表達量均顯著升高（P＜0.05）。采用MG132處理野生型小鼠胰島細胞和PUMA-/-小鼠胰島細胞24 h后，野生型小鼠胰島細胞凋亡率顯著高于PUMA-/-小鼠（P＜0.05）。見圖4。

圖4 不同處理組MIN6細胞凋亡相關(guān)基因、蛋白表達量的比較和不同小鼠胰島細胞凋亡情況

2.3 不同處理組β細胞凋亡和凋亡相關(guān)基因、蛋白表達量的比較

棕櫚酸酯組β細胞凋亡率均顯著高于SFN組、SFN+棕櫚酸酯組和對照組（P＜0.05），SFN組、SFN+棕櫚酸酯組及對照組之間β細胞凋亡率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。棕櫚酸酯組AFT4蛋白、Chop蛋白、Bip蛋白和PUMA mRNA均顯著高于對照組（P＜0.05），而SFN+棕櫚酸酯組與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 棕櫚酸酯組、SFN組、SFN+棕櫚酸酯組及對照組之間β細胞凋亡和凋亡相關(guān)基因、蛋白表達量的比較

3 討論

2型糖尿病的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂所致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在胰島β細胞功能損傷中的作用和機制近年來逐漸引起學者們的重視。營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、脂質(zhì)過度負荷、脂蛋白合成增加以及病毒感染均可打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激包括3個反應：未折疊蛋白反應、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超負荷反應和固醇調(diào)節(jié)級聯(lián)反應。胰島β細胞具有高度發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激最為敏感的細胞之一。ATF6、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和Ⅰ型跨膜蛋白激酶/核糖核酸內(nèi)切酶是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種跨膜蛋白。正常情況下，這些跨膜蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白Bip穩(wěn)定結(jié)合，處于未激活狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過誘導Chop基因的表達，激活下游促凋亡基因表達，ATF4、ATF6和蛋白50（protein 50，p50）可增加Chop基因的表達。Chop促進細胞調(diào)亡的機制包括：（1）下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2表達，Bcl-2主要存在于線粒體內(nèi)膜，可以抑制線粒體細胞色素c的釋放，從而減少胞質(zhì)細胞色素c激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶9導致的細胞凋亡；（2）Chop基因表達增加可產(chǎn)生耗竭谷胱甘肽、促進活性氧簇產(chǎn)生等效應[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激還可通過Tribbles同源蛋白3、Akt和叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型（forkhead box O3a，F(xiàn)oxO3a）的復雜途徑引起B(yǎng)H3蛋白的PUMA活化，參與p53誘導的細胞凋亡。有研究結(jié)果顯示，BH3蛋白PUMA在棕櫚酸酯誘導的細胞凋亡中起重要作用[4]。

在脂毒性作用下，β細胞中UPS的失活機制可能包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機制。有研究結(jié)果顯示，棕櫚酸酯可誘導人胰島中PSMC4和PSMA7基因上調(diào)及PSMD8和PSMB10基因下調(diào)[5]，這些基因與蛋白酶體的功能和活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)FA和棕櫚酸酯可顯著提升氧化應激相關(guān)基因、蛋白的表達量，同時Ub表達量顯著升高、蛋白酶體活性降低，提示在脂毒性作用下，β細胞的蛋白酶體活性降低，與SHANG等[6]的研究結(jié)論（由于FFA和棕櫚酸酯的氧化增加了活性氧的產(chǎn)生，導致UPS發(fā)生轉(zhuǎn)錄后失活，改變了蛋白酶體的圓柱結(jié)構(gòu)）一致。有研究結(jié)果顯示，在給小鼠喂食高脂飼料或人類食用高脂肪飲食后會產(chǎn)生過量的飽和脂肪，過量飽和脂肪可能會抑制與UPS相關(guān)的酶的活性[7]。另外，U3泛素連接酶活性改變等替代途徑也可能有助于棕櫚酸酯誘導的蛋白質(zhì)泛素化[8]。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸酯處理24 h后MIN6細胞ATF4 mRNA、Bip mRNA和Chop mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），與文獻報道[9]一致，提示棕櫚酸酯可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物ATF4、Chop和Bip的表達，介導β細胞凋亡。棕櫚酸酯處理24 h后Akt表達量顯著降低（P＜0.05），PUMA mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），棕櫚酸酯組β細胞凋亡率均顯著高于SFN組、SFN+棕櫚酸酯組和對照組（P＜0.05），SFN組、SFN+棕櫚酸酯組及對照組之間β細胞凋亡率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證實SFN可預防棕櫚酸酯誘導的細胞死亡。本研究中，棕櫚酸酯組AFT4蛋白、Chop蛋白、Bip蛋白和PUMA mRNA均顯著高于對照組（P＜0.05），而SFN+棕櫚酸酯組與對照組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明SFN能夠降低棕櫚酸酯誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志物AFT4、Chop、Bip和PUMA的表達，提高蛋白折疊能力，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔，有利于恢復β細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持β細胞存活。

值得注意的是，UPS失活引起的細胞死亡與SFN激活的蛋白酶體相反。蛋白酶體激活劑SFN在研究中被建議作為針對各種糖尿病并發(fā)癥（腎病和主動脈損傷等）的可能治療方法[10]。β細胞中SFN保護的機制包括Ub減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減輕、PUMA激活以及Bcl-2蛋白上調(diào)。SFN還可通過滅活氧化應激來誘導β細胞保護[11]。長時間的SFN暴露可以減弱胰島β細胞中葡萄糖刺激的胰島素分泌[12]。

綜上所述，F(xiàn)FA和棕櫚酸酯可產(chǎn)生氧化應激反應，導致UPS調(diào)節(jié)失活，Ub水平升高，引起蛋白酶體結(jié)構(gòu)改變，活性降低，從而導致相關(guān)凋亡基因啟動，促使胰島β細胞凋亡。SFN能夠降低氧化應激標志物的表達水平，改善氧化應激狀態(tài)，激活蛋白酶體活性，從而減少胰島β細胞的凋亡。本研究闡明了FFA誘導β細胞凋亡的機制，為2型糖尿病的治療提供了潛在的靶點。