袁應(yīng)選， 袁 琳， 汪 珍， 陳 超

（1.西安電力中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710032；2.西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710000；3. 深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，廣東 深圳 518000）

惡性腫瘤的臨床診斷、術(shù)后以及放化療的療效觀察均需要一個(gè)重復(fù)性較好的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行指導(dǎo)。臨床上人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）、癌胚抗原、甲胎蛋白、前列腺特異性抗原等腫瘤標(biāo)志物的濃度范圍往往跨度非常大，低值、中值、高值、超高值樣本在臨床上經(jīng)常遇到，但無(wú)論是哪個(gè)濃度值區(qū)間的樣本，均需通過(guò)規(guī)范化檢測(cè)才能得到其準(zhǔn)確的測(cè)定值[1-3]?；瘜W(xué)發(fā)光法易受反應(yīng)條件，如pH值、離子強(qiáng)度、溶液組成、溫度等的影響[4]。這些影響因素主要體現(xiàn)在超高值樣本稀釋時(shí)對(duì)稀釋液的選擇上。根據(jù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理，稀釋比例是免疫結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素之一，對(duì)樣本的準(zhǔn)確檢測(cè)可能存在較為顯著的影響，而等價(jià)帶區(qū)域是這類免疫檢測(cè)的理想?yún)^(qū)域[5]。因此，有必要對(duì)稀釋比例進(jìn)行精確選擇。本研究以hCG項(xiàng)目檢測(cè)為例，探討關(guān)于化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)濃度超高值樣本最佳稀釋比例的獲取及使用方法。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

收集2019年6月—2020年12月西安電力中心醫(yī)院產(chǎn)科門診送檢的hCG超高值（＞5 000.0 mIU/mL）血液樣本。

1.2 儀器與試劑

MAGLUMI 4000 Plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（深圳新產(chǎn)業(yè)公司）及配套hCG試劑盒（批號(hào)0171900401）。質(zhì)控品購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司（批號(hào)40382）。

1.3 方法

各實(shí)驗(yàn)室在制作定標(biāo)曲線時(shí)均會(huì)使用高、低值定標(biāo)品，這為實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的比對(duì)打下基礎(chǔ)。鑒于本研究探討的是超高值樣本檢測(cè)，為了能更有效地發(fā)揮定標(biāo)曲線的性能，我們選擇定標(biāo)曲線高值定標(biāo)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的相對(duì)光強(qiáng)度（relative light unit，RLU）值（1 319 511）作為實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果比較的參照點(diǎn)。

采用試劑盒配套的稀釋液（成分為小牛血清加0.2%疊氮鈉）對(duì)1份初測(cè)（1∶100稀釋[6]）hCG濃度為292 613.3 mIU/mL的超高值血清樣本按儀器給定的系列稀釋比例（儀器說(shuō)明書提供的可自動(dòng)稀釋的比例為1∶2、1∶4、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶90、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 500）進(jìn)行自動(dòng)稀釋檢測(cè)[6-7]，檢測(cè)3次，取平均值。將收集的222份hCG超高值樣本用相同方法稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 最佳稀釋比例的獲取

在對(duì)1份超高值血清樣本[初測(cè)（1∶100稀釋）hCG為292 613.3 mIU/mL]按儀器給定的系列稀釋比例進(jìn)行自動(dòng)稀釋檢測(cè)的結(jié)果中，原倍血清及1∶20、1∶50稀釋的檢測(cè)結(jié)果存在明顯的稀釋不足現(xiàn)象（后帶效應(yīng)），1∶500及以上稀釋的檢測(cè)結(jié)果存在過(guò)度稀釋現(xiàn)象，見(jiàn)表1。

表1 hCG超高值樣本系列稀釋后的檢測(cè)結(jié)果

在所有hCG超高值樣本的系列稀釋結(jié)果中，RLU測(cè)值最接近高值定標(biāo)品RLU參數(shù)值時(shí)所對(duì)應(yīng)的稀釋比例應(yīng)為最佳的稀釋比例，由最佳稀釋比例換算所得的值則為較穩(wěn)定且準(zhǔn)確的測(cè)定值。故針對(duì)該份樣本求得的最佳稀釋比例為1∶200。

2.2 同一份超高值樣本不同稀釋比例稀釋以及最佳稀釋比例下的檢測(cè)結(jié)果分析

采用表1中的任意稀釋比例，對(duì)1份hCG超高值樣本進(jìn)行稀釋并重復(fù)檢測(cè)20次，hCG檢測(cè)結(jié)果為（351 708.9±73 191.5）mIU/mL，CV為20.81%。按最佳稀釋比例（1∶200），對(duì)同一份hCG超高值樣本重復(fù)檢測(cè)20次，hCG檢測(cè)結(jié)果為（308 669.5±10 247.8）mIU/mL，CV為3.32%。2個(gè)檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.917，P=0.006）。

將該份hCG超高值樣本分裝成20份，外送至使用相同檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室，采用最佳稀釋比例（1∶200）進(jìn)行稀釋并檢測(cè)，hCG結(jié)果為（309 537.9±12 190.4）mIU/mL，CV為3.93%。該檢測(cè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室采用最佳稀釋比例（1∶200）得出的檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.811，P=0.422）。

2.3 222份超高值樣本原倍血清的RLU值范圍及其所選擇的對(duì)應(yīng)稀釋比例匯總

對(duì)222份hCG超高值樣本原倍血清的RLU值范圍及其可選擇的對(duì)應(yīng)稀釋比例進(jìn)行匯總，結(jié)果顯示，在實(shí)際應(yīng)用中，只需按照超高值樣本原倍血清的初始RLU值，根據(jù)表2中給出的RLU值所對(duì)應(yīng)的3～4個(gè)備選稀釋比例分別進(jìn)行檢測(cè)，可快速、準(zhǔn)確地挑選出最佳稀釋比例。

表2 222份超高值樣本原倍血清的RLU值范圍及其可選擇的對(duì)應(yīng)稀釋比例匯總

3 討論

腫瘤標(biāo)志物超高值樣本的規(guī)范化檢測(cè)直接影響其臨床指導(dǎo)意義，最佳稀釋比例的科學(xué)求取方法能促進(jìn)此類檢測(cè)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室間互認(rèn)。超高值樣本檢測(cè)結(jié)果的互認(rèn)需要一個(gè)可供比較的平臺(tái)，若各平臺(tái)之間缺少公認(rèn)的稀釋參照點(diǎn)，自由選擇稀釋比例，那么得出的結(jié)果必然重復(fù)性較差，無(wú)可比性。本研究結(jié)果顯示，對(duì)同一份hCG超高值樣本采用不同稀釋比例進(jìn)行稀釋檢測(cè)，其極差為150 700.2 mIU/mL，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出臨床可接受范圍。以定標(biāo)曲線高值定標(biāo)點(diǎn)RLU值為稀釋參照點(diǎn)，選擇稀釋后RLU值最接近高值定標(biāo)點(diǎn)RLU值所對(duì)應(yīng)的稀釋比例為最佳稀釋比例，由最佳稀釋比例換算的測(cè)定值最具有可比性。雖然已有多個(gè)學(xué)者探討過(guò)最佳稀釋比例問(wèn)題，但均未涉及稀釋參照點(diǎn)的選擇[6-7]。如果不涉及稀釋參照點(diǎn)，隨著樣本被測(cè)物濃度的進(jìn)一步提升，最佳稀釋比例也將增大，可能就不止1∶100這1個(gè)稀釋比例[6]。因此，首選1∶100作為最佳稀釋比例的臨床應(yīng)用價(jià)值是有限的。

綜上所述，結(jié)合試劑定標(biāo)曲線高值定標(biāo)點(diǎn)參數(shù)RLU值去選擇最佳稀釋倍數(shù)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，不但解決了正反應(yīng)曲線（如腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)項(xiàng)目）的超線性范圍樣本的精準(zhǔn)檢測(cè)問(wèn)題，還為反曲線（倒S形）檢測(cè)項(xiàng)目（如甲狀腺激素）超線性檢測(cè)提供了可行的方法。