王進軍， 文 斌， 金 陽， 楊是修， 王 可， 朱 彤， 胡思杏

1武漢市中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科，武漢 430010 2恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院推拿科，恩施 445099 3湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430065

乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一，在過去的幾十年里，發(fā)病率持續(xù)上升[1]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌的一個亞型，其典型特征是雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epithelial growth factor receptor 2，HER2)均為陰性，目前缺乏有效的靶向治療[2]。TNBC可進一步分為基底樣亞型1(basal-like 1，BL1)、基底樣亞型2(basal-like 2，BL2)、間充質(zhì)亞型(mesenchymal，M)和管腔雄激素受體亞型(luminal androgen receptor，LAR)[3]。其中LAR亞型高表達雄激素受體(androgen receptor，AR)及其下游靶點[4]。Gerratana等[5]綜述了AR的生物學(xué)進展，并指出AR可作為TNBC亞型的新興治療靶點。雷公藤內(nèi)酯(triptolide，TP)是從雷公藤中提取的中藥單體，具有多種生物學(xué)功能[6-7]。研究表明，TP可通過調(diào)控細胞凋亡途徑來發(fā)揮抗癌作用[8-10]。Wu等[11]研究結(jié)果顯示，TP和AG1024以劑量依賴的方式抑制2種TNBC細胞系的增殖活力。Varghese等[12]研究表明，TP可抑制TNBC細胞增殖，誘導(dǎo)自噬并激活細胞凋亡。但有關(guān)TP對AR調(diào)控機制的研究鮮有報道，因此，本研究旨在探討TP對TNBC細胞MDA-MB-468的作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468(中國科學(xué)院上海細胞庫)，L15培養(yǎng)液(Solarbio公司)，胎牛血清(AusGeneX公司)，CCK-8(Meilune公司)，雷公藤內(nèi)酯醇(Aladdin公司)，Pifithrin-α(MCE公司)，Matrigel膠(Jichun公司)，Transwell小室(Corning公司)，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(HaiGene公司)，Trizol(Ambion公司)，SYBR FAST qPCR Master Mix(KAPA Biosystems公司)，裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio公司)，PVDF轉(zhuǎn)移膜和化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore公司)，兔抗雄激素受體抗體、兔抗p53抗體、兔抗GAPDH和羊抗兔IgG(Bioswamp公司)。

1.2 細胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

將凍存的細胞從液氮罐中取出，于37℃水浴中解凍。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，400×g離心3 min，棄上清，加入1 mL培養(yǎng)液后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。加入4 mL含10%胎牛血清的L15進行培養(yǎng)，置于37℃、100%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測

收集細胞，調(diào)整細胞懸液濃度接種于96孔板，每孔3×103個細胞，每孔體積為100 μL，置于37℃、100%空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。將細胞分為5組，對照組細胞正常進行培養(yǎng)，其他4組為培養(yǎng)液中分別加入濃度為12.5、25、50和100 nmol/L TP，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。取出細胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值。計算細胞存活率，篩選TP最佳濃度(50 nmol/L)和作用時間(48 h)。

將細胞分為4組：對照組、TP組(50 nmol/L TP作用48 h)、p53抑制劑組(20 μmol/L Pifithrin-α作用48 h)和TP+p53抑制劑組(50 nmol/L TP+20 μmol/L Pifithrin-α作用48 h)進行后續(xù)實驗。

1.4 Transwell小室檢測

接種前將24孔板和Transwell小室在PBS中浸泡5 min，在Transwell小室中鋪80 μL Matrigel膠，放置30 min。采用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL接種到Transwell小室內(nèi)，每個小室0.5 mL細胞懸液；在Transwell小室下層24孔板中加入0.75 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，加入1 mL PBS清洗1次，每孔加入1 mL 4%甲醛室溫固定20 min。吸去固定液，PBS清洗1次，每孔加入1 mL 0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min后PBS清洗3次，晾干。用棉簽擦去Transwell小室內(nèi)未侵襲的細胞，顯微鏡下觀察，計數(shù)每個視野中的細胞數(shù)。

1.5 流式細胞術(shù)檢測

收集各組細胞，取1×106個細胞重懸，400×g，4℃離心5 min，棄上清。加入1 mL PBS重懸細胞，400×g離心5 min，棄上清。加入200 μL PBS重懸細胞，加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min。加入300 μL PBS，進行流式細胞儀上機檢測。

1.6 qRT-PCR檢測

收集各組細胞，加1 mL Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增體系為：10 μL SYBR FAST qPCR Master Mix，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1 μL cDNA模板，8 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共40個循環(huán)。其中GAPDH作為內(nèi)參進行樣品間的校正，使用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.7 Western blot檢測

收集各組細胞約1×106個，加200 μL裂解液4℃，12000×g離心10 min，取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。以每孔20 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，分別加入兔抗HIF-1α(稀釋比1∶1000)、兔抗VEGF(稀釋比1∶1000)、兔抗Myc(稀釋比1∶1000)、兔抗MMP-2(稀釋比1∶1000)、兔抗MMP-9(稀釋比1∶1000)和兔抗GAPDH(稀釋比1∶1000)，室溫孵育1 h。洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑，曝光顯影后，讀取蛋白條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 篩選TP最佳作用濃度和時間

采用CCK-8檢測MDA-MB-468細胞增殖活力，篩選TP最佳作用濃度和時間。結(jié)果如圖1所示，不同濃度TP分別作用MDA-MB-468細胞24、48和72 h后，隨著TP濃度升高及作用時間延長，細胞增殖活力逐漸下降。當TP濃度為50 nmol/L且處理48 h時，細胞存活率為(63.69±1.37)%。因此后續(xù)實驗均為50 nmol/L TP作用48 h處理MDA-MB-468細胞。

1：對照組；2：12.5 nmol/L TP；3：25 nmol/L TP；4：50 nmol/L TP；5:100 nmol/L TP圖1 TP不同作用濃度和時間對MDA-MB-468細胞增殖活力的影響Fig.1 Effects of TP at different concentrations and time lengths on proliferation activity of MDA-MB-468 cells

2.2 TP抑制三陰性乳腺癌細胞增殖

采用CCK-8檢測TP對MDA-MB-468細胞增殖的影響。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，TP組細胞增殖活力顯著降低(P<0.05)；與TP組相比，p53抑制劑組細胞增殖活力顯著升高(P<0.05)；與p53抑制劑組相比，TP+p53抑制劑組細胞增殖活力顯著降低(P<0.05)。

1：對照組；2：TP組；3：p53抑制劑組；4：TP+p53抑制劑組；與對照組比較，*P<0.05；與TP組比較，#P<0.05；與p53抑制劑組比較，△P<0.05圖2 TP對MDA-MB-468細胞增殖的影響Fig.2 Effect of TP on proliferation of MDA-MB-468 cells

2.3 TP抑制三陰性乳腺癌細胞侵襲

采用Transwell小室檢測TP對MDA-MB-468細胞侵襲的影響。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，TP組侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)；與TP組相比，p53抑制劑組侵襲細胞數(shù)顯著增多(P<0.05)；與p53抑制劑組相比，TP+p53抑制劑組侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。

1：對照組；2：TP組；3：p53抑制劑組；4：TP+p53抑制劑組；與對照組比較，*P<0.05；與TP組比較，#P<0.05；與p53抑制劑組比較，△P<0.05圖3 TP對MDA-MB-468細胞侵襲的影響(×200)Fig.3 Effect of TP on invasion of MDA-MB-468 cells(×200)

2.4 TP促進三陰性乳腺癌細胞凋亡

采用流式細胞術(shù)檢測TP對MDA-MB-468細胞凋亡的影響。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，TP組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與TP組相比，p53抑制劑組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與p53抑制劑組相比，TP+p53抑制劑組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。表明TP可顯著促進MDA-MB-468細胞凋亡。

1：對照組；2：TP組；3：p53抑制劑組；4：TP+p53抑制劑組；與對照組比較，*P<0.05；與TP組比較，#P<0.05；與p53抑制劑組比較，△P<0.05圖4 TP對MDA-MB-468細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of TP on apoptosis of MDA-MB-468 cells

2.5 TP對MDA-MB-468細胞中AR和p53表達的影響

采用qRT-PCR和Western blot檢測TP對MDA-MB-468細胞中AR和p53表達水平的影響。結(jié)果如圖5和圖6所示，與對照組相比，TP組細胞中AR表達水平顯著降低(P<0.05)；p53表達水平顯著升高(P<0.05)；與TP組相比，p53抑制劑組細胞中AR表達水平顯著升高(P<0.05)，p53表達水平顯著降低(P<0.05)；與p53抑制劑組相比，TP+p53抑制劑組細胞中AR表達水平顯著降低(P<0.05)，p53表達水平顯著升高(P<0.05)。

1：對照組；2：TP組；3：p53抑制劑組；4：TP+p53抑制劑組；與對照組比較，*P<0.05；與TP組比較，#P<0.05；與p53抑制劑組比較，△P<0.05圖5 TP對MDA-MB-468細胞中AR和p53 mRNA表達的影響Fig.5 Effects of TP on AR and p53 mRNA expression in MDA-MB-468 cells

1：對照組；2：TP組；3：p53抑制劑組；4：TP+p53抑制劑組；與對照組比較，*P<0.05；與TP組比較，#P<0.05；與p53抑制劑組比較，△P<0.05圖6 TP對MDA-MB-468細胞中AR和p53蛋白表達的影響Fig.6 Effects of TP on AR and p53 protein expression in MDA-MB-468 cells

3 討論

TNBC為乳腺癌的一種亞型，具有高度異質(zhì)性，侵襲性強，且預(yù)后較差[13]。TP是從中藥雷公藤中分離出的一種二萜類生物活性化合物，具有有效的抗癌作用，涉及多個分子靶點和信號通路[14-15]。胡清福等[16]研究結(jié)果表明，TP可誘導(dǎo)TNBC細胞凋亡，其作用機制可能與抑制細胞中BRCA1的表達及磷酸化水平有關(guān)。孫巍等[17]研究結(jié)果顯示，TP可通過抑制RCC1/PARP1信號通路的傳導(dǎo)，阻止順鉑引起的DNA損傷修復(fù)，增強TNBC細胞對順鉑的敏感性。有研究顯示10%～50%的TNBC患者表達AR[18-21]，且AR可作為治療TNBC的新興靶點[5]，目前也有較多研究報道了TP在TNBC治療中的作用，但有關(guān)TP對TNBC細胞中AR的調(diào)控機制仍需進一步研究。

本研究將不同濃度TP作用于MDA-MB-468細胞篩選出TP的最佳作用濃度后，CCK-8、Transwell小室實驗和流式細胞術(shù)檢測的結(jié)果顯示，TP能顯著抑制MDA-MB-468細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡。p53是細胞內(nèi)重要的抑癌基因，在TNBC中失活時可促進轉(zhuǎn)移擴散和復(fù)發(fā)[22]。姚方輝[23]研究發(fā)現(xiàn)，TP可能通過上調(diào)p53啟動線粒體凋亡途徑從而促進TNBC細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，p53抑制劑處理后，MDA-MB-468細胞增殖活力和侵襲能力顯著升高，凋亡率顯著降低；而TP和p53抑制劑聯(lián)合處理后，逆轉(zhuǎn)了p53抑制劑對MDA-MB-468細胞的作用，這表明TP可能通過p53發(fā)揮抑制MDA-MB-468細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡的作用。AR是一種類固醇激素受體，是目前TNBC靶向治療的研究熱點。Liu等[24]和Traina等[25]研究結(jié)果表明，AR抑制劑藥物恩雜魯胺可抑制TNBC細胞增殖活力，患者臨床受益率可達33%。在本研究中，為了探討TP是否能通過p53調(diào)控AR影響MDA-MB-468細胞增殖、侵襲和凋亡，我們也設(shè)置了p53抑制劑組以及TP與p53抑制劑聯(lián)合處理組。本研究結(jié)果顯示，TP可顯著抑制MDA-MB-468細胞中AR的表達；抑制p53表達可上調(diào)AR表達水平；當TP與p53抑制劑聯(lián)合作用時，TP可逆轉(zhuǎn)p53抑制劑對AR的促進作用，表明TP可通過p53調(diào)控MDA-MB-468細胞中AR的表達。

綜上所述，TP可抑制TNBC細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡，其作用機制可能與上調(diào)p53的表達進而下調(diào)AR的表達水平有關(guān)。為TP治療TNBC的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。