李偉緒 張勉 盧夢(mèng) 張浩 盧曉琳 曹猛

牙周炎是一種由細(xì)菌引起的慢性感染性疾病，可導(dǎo)致牙周韌帶和鄰近的牙槽骨破壞［1］。其是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因并與多種全身系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)［2］。但傳統(tǒng)牙周炎治療方法效果有限，因此近年來利用間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)重建牙周組織成為牙周炎治療的新方向［3］。牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是一種來源于牙周膜的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能。目前研究已證實(shí)正常牙周組織來源的PDLSCs在動(dòng)物與人體內(nèi)的牙周組織重建中均取得了良好的效果［4－5］。但是，在炎癥微環(huán)境條件下，PDLSCs的生物學(xué)特性發(fā)生轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)功能和再生潛能受損成為炎性PDLSCs。如何逆轉(zhuǎn)炎性PDLSCs的生物學(xué)特性、使其充分發(fā)揮牙周組織再生的關(guān)鍵作用，已成為相關(guān)領(lǐng)域研究的關(guān)鍵問題［6］。單免疫球蛋白白細(xì)胞介素1受體相關(guān)蛋白（single Ig IL-1-related receptor，SIGIRR），又稱 Toll／白細(xì)胞介素 1受體8（interleukin-1 receptor8，IL-1R8），是含有TIR結(jié)構(gòu)域的受體家族中的一員，抑制白細(xì)胞介素1受體（interleukin-1 receptors，IL-1R）和Toll樣受體（toll-like receptors，TLR）信號(hào)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用［7］。然而，SIGIRR在PDLSCs是否表達(dá)，其是否參與PDLSCs的炎癥反應(yīng)目前尚未見報(bào)道。

本研究通過免疫熒光驗(yàn)證了SIGIRR在PDLSCs中表達(dá)，之后用RT-PCR檢測(cè)模擬炎癥微環(huán)境下不同刺激濃度與時(shí)長下PDLSCs中SIGIRR的表達(dá)水平。并通過在上調(diào)PDLSCs中的SIGIRR表達(dá)后，再施加炎癥刺激，觀察相關(guān)炎癥因子表達(dá)變化，探討 SIGIRR在PDLSCs中的抗炎作用，為牙周的治療提供研究基礎(chǔ)和治療方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國）；I型膠原酶、脂多糖（LPS）（Sigma，美國）；實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）；SIGIRR（1∶500，Gene Tex，美國）；引物 （北京奧科生物）；胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技公司）；SIGIRR過表達(dá)質(zhì)粒（上海吉滿生物科技公司）；Real-time PCR（7500 Applied Biosystems，美國）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDLSCs的分離與培養(yǎng) 采用年齡18～35歲患者拔除的正畸牙，用PBS沖洗后取牙周膜組織，加入Ⅰ型膠原酶，37℃避光消化1 h。加入培養(yǎng)液終止后800 r／min離心5min，棄上清液后完全培養(yǎng)基重懸接種于六孔板中，放置在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。原代牙周膜干細(xì)胞為從組織塊中爬出的細(xì)胞，經(jīng)過干細(xì)胞鑒定與成骨成脂分化實(shí)驗(yàn)與克隆形成實(shí)驗(yàn)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 不同濃度LPS刺激下炎癥因子與SIGIRR表達(dá)變化 分別接種P3的PDSLCs于六孔板和共聚焦小皿中，細(xì)胞匯合度達(dá)90%后，分別加入0、10、100、1 000 ng／mL LPS模擬炎癥刺激，6 h后提取RNA，檢測(cè)各組IL-6、IL-8、TNF-α與SIGIRR的表達(dá)水平，引物序列見表1。而共聚焦小皿中細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，15 min后加入0.2% Triton X-100，10 min后PBS沖洗，加入5%山羊血清室溫封閉，30 min后加入一抗4℃過夜孵育。次日PBS沖洗后加入熒光二抗室溫避光孵育，2 h后PBS沖洗加入DAPI室溫染色，20min后用PBS清洗在共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.3 不同時(shí)長LPS刺激下PDLSCs的SIGIRR與炎癥因子表達(dá)變化 接種P3的PDLSCs于六孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)90%后，在PDLSCs中加入1 000 ng／mL LPS模擬炎癥刺激，分別于LPS刺激0、3、6、12、24 h后提取RNA，檢測(cè)各組SIGIRR與炎癥因子的表達(dá)水平。

1.2.4 SIGIRR過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 PDLSCs后，在 LPS刺激下炎癥因子的表達(dá)變化 將P3細(xì)胞接種至六孔板，轉(zhuǎn)染前12 h換不含血清與雙抗的培養(yǎng)液，細(xì)胞匯合度達(dá)70%。轉(zhuǎn)染試劑為X-treme GENE HP DNA，實(shí)驗(yàn)組（OE）加入SIGIRR過表達(dá)質(zhì)粒，正常對(duì)照組（NC）加入空白質(zhì)粒，6 h后更換為完全培養(yǎng)基。48 h后提取RNA檢測(cè)其過表達(dá)效率。SIGIRR過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PDLSCs 48 h后，加入終濃度1 000 ng／mL LPS培養(yǎng)6 h后提取RNA，檢測(cè)各組IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用 One-way ANOVA，P＜0.05即統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 隨著LPS濃度增加，炎癥因子表達(dá)不斷上調(diào)

對(duì)PDLSCs進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)施加不同濃度的LPS誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，培養(yǎng)6 h后提取細(xì)胞mRNA，RT-PCR結(jié)果表明，隨著LPS濃度增加，PDLSCs的IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表達(dá)逐漸升高（圖1）。

2.2 SIGIRR表達(dá)隨著LPS的濃度增加不斷下降

為了明確PDLSCs中是否有SIGIRR的表達(dá)，我們首先用免疫熒光染色檢測(cè)了正常培養(yǎng)條件下PDLSCs中SIGIRR蛋白的表達(dá)，共聚焦熒光圖像顯示PDLSCs中有SIGIRR表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。而利用LPS刺激PDLSCs后，SIGIRR的熒光強(qiáng)度顯著降低，且隨著LPS濃度增加，SIGIRR表達(dá)逐漸下調(diào)，當(dāng)LPS濃度為1 000 ng／mL時(shí)熒光強(qiáng)度最弱，RT-PCR結(jié)果也與之相似（圖2）。

圖2 不同LPS濃度對(duì)SIGIRR表達(dá)水平的影響Fig 2 The effects of different LPS concentrations on the expression of SIGIRR

2.3 隨著LPS刺激時(shí)間增加，SIGIRR表達(dá)先下降后恢復(fù)正常，炎癥因子表達(dá)先上升后下降

在LPS濃度為 1 000 ng／mL時(shí)不同時(shí)間刺激PDLSCs，隨著LPS刺激時(shí)長增加SIGIRR表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)下調(diào)，到6 h時(shí)表達(dá)水平最低，隨后逐漸上升并在24 h時(shí)恢復(fù)到原來水平。與之相反，炎癥因子表達(dá)先升高后降低（圖3）。

圖3 不同LPS刺激時(shí)間對(duì)SIGIRR與炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig 3 The effect of different LPS stimulation time on the expression of SIGIRR and inflammatory factors

2.4 過表達(dá)SIGIRR后，LPS刺激下的PDLSCs炎癥因子表達(dá)下調(diào)

相對(duì)于NC組，OE組PDLSCs中SIGIRR的上調(diào)顯著（圖4）。對(duì)SIGIRR過表達(dá)組施加LPS刺激，RTPCR結(jié)果顯示相對(duì)于 LPS刺激組和 NC＋LPS組，OS＋LPS組的 PDLSCs中 IL-6、IL-8、和 TNF-α的表達(dá)均顯著降低（圖5）。

圖4 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與過表達(dá)效率Fig 4 Overexpression plasmid transfection and overexpression efficiency

圖5 LPS刺激過表達(dá)SIGIRR的PDLSCs后炎癥因子表達(dá)水平變化Fig 5 Changes in the expression of inflammatory cytokines after LPS stimulation of PDLSCs overexpressing SIGIRR

3 討 論

牙周炎是由菌斑微生物所引發(fā)的多種因素參與的慢性感染性疾?。?］。牙菌斑是導(dǎo)致牙周炎的始動(dòng)因素［9］，致病菌可釋放包括LPS在內(nèi)的多種毒力因子。LPS可刺激牙周膜中的PDLSCs分泌 TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子，促進(jìn)牙周膜和牙槽骨的破壞［1］，使PDLSCs持續(xù)處于炎癥刺激中，生理功能與多向分化能力都發(fā)生改變［10］，進(jìn)而導(dǎo)致牙周組織的自我修復(fù)能力減弱，加速牙周炎的進(jìn)展。因此本實(shí)驗(yàn)選擇LPS模擬炎癥微環(huán)境，探索SIGIRR對(duì)PDLSCs炎癥狀態(tài)的影響。

SIGIRR是 IL-1R／TLR受體超家族成員，在 IL-1R／TLR受體的負(fù)性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用［11］。SIGIRR廣泛表達(dá)于多種上皮組織，尤其是腎、消化道、肝、肺和淋巴器官的上皮細(xì)胞［12］。本課題組通過免疫熒光首次證實(shí)SIGIRR也表達(dá)于PDLSCs中，且與PDLSCs的炎癥反應(yīng)調(diào)控密切相關(guān)。當(dāng)LPS濃度為1 000 ng／mL時(shí)，PDLSCs處于明顯的炎癥狀態(tài)中，炎癥因子的表達(dá)水平最高。而與之對(duì)應(yīng)地，此時(shí)SIGIRR表達(dá)下調(diào)也最多。這也與Li等［13］用LPS刺激膀胱上皮細(xì)胞所得出得結(jié)論相同，該結(jié)果提示SIGIRR表達(dá)顯著降低可能是PDLSCs抗炎能力降低的原因之一。然而LPS導(dǎo)致的SIGIRR的下調(diào)并不是持續(xù)性的，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在LPS刺激6 h時(shí)，SIGIRR下調(diào)最多，之后隨著刺激時(shí)間延長SIGIRR的表達(dá)水平又逐漸恢復(fù)到正常水平，而炎癥因子的表達(dá)水平與之正相反，表現(xiàn)為先升高后降低。這表明SIGIRR可能在早期下調(diào)增強(qiáng)牙周組織的炎癥反應(yīng)，并在組織損傷過程中清除病原菌。而隨后的上調(diào)可以反過來減輕炎癥反應(yīng)而造成的損害，SIGIRR在炎癥刺激下的表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化可以維持PDLSCs在炎癥反應(yīng)中的動(dòng)態(tài)平衡。

有研究報(bào)道LPS刺激小腸上皮細(xì)胞時(shí)，其炎癥因子表達(dá)升高同轉(zhuǎn)錄因子SP1與SIGIRR啟動(dòng)子結(jié)合能力的下降相關(guān)，而SP1與SIGIRR啟動(dòng)子結(jié)合活性隨LPS刺激時(shí)間的變化趨勢(shì)也與SIGIRR的變化趨勢(shì)相同［14］。由于 SIGIRR在 IL-1R／TLR受體所參與的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用，下調(diào)SIGIRR會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞炎癥程度加重，并且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明感染結(jié)核分枝桿菌的SIGIRR基因缺陷小鼠與對(duì)照組相比發(fā)生了劇烈的炎癥反應(yīng)［15］。為此本實(shí)驗(yàn)上調(diào)了PDLSCs中的SIGIRR表達(dá)水平，而后用LPS模擬炎癥刺激發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIGIRR組的細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-8表達(dá)水平均低于對(duì)照組。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步印證了SIGIRR在PDLSCs的炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮抗炎作用。

以上結(jié)果表明，SIGIRR參與了PDLSCs炎癥反應(yīng)的調(diào)控，SIGIRR的表達(dá)也受炎癥反應(yīng)影響。但是炎癥反應(yīng)如何影響了SIGIRR的表達(dá)，SIGIRR表達(dá)變化后又會(huì)對(duì)牙周炎進(jìn)程產(chǎn)生怎樣的作用尚不清楚，這些相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。