張怡林 安瑩 陳發(fā)明

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是一種來源于牙周膜組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有良好的增殖和多向分化潛能，并且表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記物，被認(rèn)為是牙周組織再生的種子細(xì)胞［1－2］。然而研究表明，糖尿病患者的高血糖微環(huán)境可損害干細(xì)胞性能，進(jìn)而阻礙糖尿病患者的組織再生進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)的增殖能力下降、凋亡水平升高［3－4］；另一方面，體外高糖環(huán)境培養(yǎng)的干細(xì)胞也表現(xiàn)出成骨分化潛能減弱［5－6］。因此，高糖環(huán)境下 PDLSCs的多向分化潛能受損，可能是糖尿病患者牙周組織再生困難的關(guān)鍵原因。

細(xì)胞生活的體內(nèi)環(huán)境中具有廣泛的細(xì)胞－細(xì)胞以及細(xì)胞－細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，調(diào)控著細(xì)胞的生長及代謝活動［7］。但在傳統(tǒng)的體外二維培養(yǎng)條件下，這些相互作用顯著減少，進(jìn)而引起細(xì)胞的形態(tài)、生物學(xué)行為等發(fā)生改變，與細(xì)胞在體內(nèi)的真實狀態(tài)存在明顯差別［8］。因此，構(gòu)建合適的體外培養(yǎng)條件以模擬細(xì)胞生活的體內(nèi)微環(huán)境，是研究高糖環(huán)境下PDLSCs生物學(xué)行為和性能變化的重要基礎(chǔ)。本實驗以PDLSCs為研究對象，利用明膠和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶材料構(gòu)建體外三維培養(yǎng)條件，觀察高糖環(huán)境對PDLSCs成骨和成脂分化潛能的影響，以期深入探討基于PDLSCs的干細(xì)胞療法在糖尿病患者牙周組織再生中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；ALP染料、ALP活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；茜素紅染料、油紅O染料、阿利辛藍(lán)染料（Sigma公司，美國）；明膠、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（北京唯輝生物有限公司）。Real Time PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人PDLSCs的分離培養(yǎng) 收集新鮮拔除的第三磨牙或者因其他原因拔除的牙齒，沿著牙根小心沖洗血跡，去除牙石和牙齦組織。將牙周膜刮下，剪成小塊（約1mm×1mm×1mm），用膠原酶消化45min后離心，用低糖DMEM培養(yǎng)基重懸組織塊并轉(zhuǎn)移到六孔板中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)基。選擇長勢良好的3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 三維培養(yǎng)條件的構(gòu)建 根據(jù)材料的使用說明書，首先將明膠置于55℃水浴鍋中預(yù)熱約5 min至明膠呈液態(tài)，在超凈工作臺上靜置5 min至室溫，然后向谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶粉末中加入100μL無菌ddH2O。使用胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后將2×105個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌的1.5 mL離心管中，離心沉淀細(xì)胞后棄去培養(yǎng)基，按照2×106個細(xì)胞／mL膠加入100μL明膠后重懸細(xì)胞，然后按照明膠：谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶＝20∶1的比例加入5μL谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。吹打混合后將20μL混合液接種到24孔培養(yǎng)板（對于鬼筆環(huán)肽染色，將20 μL混合液接種于共聚焦小皿）中，將培養(yǎng)板置于孵箱中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)約45 min。待膠凝固后，向每個培養(yǎng)孔中加入2 mL完全培養(yǎng)基。2～3 d更換一次培養(yǎng)基。

1.2.3 鬼筆環(huán)肽染色 細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件中培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min。然后使用0.5%的Trixon 100溶液透析細(xì)胞15 min，用PBS溶液清洗，加入鬼筆環(huán)肽染液對細(xì)胞骨架進(jìn)行染色30 min，再次用PBS溶液清洗。然后加入DAPI溶液對細(xì)胞核進(jìn)行染色15min，使用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的伸展情況。

1.2.4 成骨和成脂誘導(dǎo) 細(xì)胞在三維培養(yǎng)條件中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至60%～70%后換成相應(yīng)的成骨或者成脂誘導(dǎo)液。對照組（CON組）誘導(dǎo)液的葡萄糖濃度為5.5 mmol／L，高糖處理組（HG組）誘導(dǎo)液的葡萄糖濃度為 25 mmol／L（糖濃度參考文獻(xiàn)［4，9－10］）。成骨或成脂誘導(dǎo)液每2 d更換一次。

1.2.5 ALP染色和活性檢測 成骨誘導(dǎo)第7天，收集培養(yǎng)基，用PBS清洗后加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30min，然后用ALP染料染色15～30min，鏡下拍攝照片。將收集的培養(yǎng)基離心5 min，取上清進(jìn)行ALP活性檢測。

1.2.6 茜素紅染色和礦化結(jié)節(jié)定量 成骨誘導(dǎo)第21天，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，然后用茜素紅染料染色5～10 min，鏡下拍攝照片。用10%十六烷基吡啶溶解礦化結(jié)節(jié)，在560 nm處檢測其吸光度值，進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)定量。

1.2.7 油紅O染色和脂滴定量 成脂誘導(dǎo)第21天，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后加入4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30min，然后使用油紅O染料染色15～30min，鏡下拍攝照片。用異丙醇溶解脂滴，在560 nm處檢測其吸光度值，進(jìn)行脂滴定量。

1.2.8 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測 使用TRIzol裂解細(xì)胞并提取RNA后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，對所得的cDNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。成骨和成脂相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有的實驗數(shù)據(jù)都至少包括3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)包括3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計，用±s表示。采用獨立樣本t檢驗對兩組間差異進(jìn)行比較，P＜0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 人PDLSCs培養(yǎng)與鑒定

人PDLSCs培養(yǎng)14 d后，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色可見藍(lán)紫色的細(xì)胞集落（圖1）；CCK-8檢測結(jié)果顯示這些細(xì)胞具有體外增殖能力（圖1）。經(jīng)成骨、成脂或成軟骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色可見紅色的礦化結(jié)節(jié)、油紅O染色可見紅色的脂滴、阿利辛藍(lán)染色可見藍(lán)色的成軟骨細(xì)胞（圖2）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示這些PDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD105、CD146），低表達(dá)CD31、CD34、CD45（圖 2）。

圖1 PDLSCs的克隆形成實驗和CCK-8實驗Fig 1 Colony forming assay and CCK-8 assay of PDLSCs

圖2 PDLSCs的多向分化潛能和免疫表型Fig 2 The multi-lineage differentiation potential and immunophenotypes of PDLSCs

2.2 三維培養(yǎng)條件下PDLSCs的形態(tài)

倒置顯微鏡可見，三維培養(yǎng)條件下PDLSCs呈圓形分層排列（圖3）。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞呈圓球形，細(xì)胞膜緊密地圍繞在細(xì)胞核的周圍（圖 3）。

圖3 三維培養(yǎng)條件下PDLSCs的形態(tài)特點 （×200）Fig 3 The morphological feature of PDLSCs under 3D culture （×200）

2.3 三維培養(yǎng)條件下高糖環(huán)境對PDLSCs成骨分化的影響

與CON組相比，HG組ALP陽性細(xì)胞減少、細(xì)胞的 ALP活性降低（P＜0.001）（圖 4）；形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少（P＜0.001）（圖 4）。qRT-PCR結(jié)果顯示，HG組 PDLSCs中成骨相關(guān)基因 RUNX2（P＜0.05）、BMP2（P＜0.05）和 OCN（P＜0.01）表達(dá)顯著降低，Col-1表達(dá)有所降低，但未見統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）。

圖4 三維培養(yǎng)條件下高糖環(huán)境對PDLSCs成骨分化的影響Fig 4 The effects of high glucose on the osteogenic differentiation of PDLSCs under 3D culture

2.4 三維培養(yǎng)條件下高糖環(huán)境對PDLSCs成脂分化的影響

油紅O染色和脂滴定量的結(jié)果顯示，與CON組相比，HG組 PDLSCs形成的脂滴增加（P＜0.01）（圖 5）。qRT-PCR結(jié)果顯示，HG組PDLSCs中成脂相關(guān)基因Adiponectin表達(dá)顯著升高（P＜0.01），PPARG表達(dá)有所升高，但未見統(tǒng)計學(xué)差異（圖5）。

圖5 三維培養(yǎng)條件下高糖環(huán)境對PDLSCs成脂分化的影響Fig 5 The effects of high glucose on the adipogenic differentiation of PDLSCs under 3D culture

3 討 論

人體內(nèi)的細(xì)胞生活在三維立體的環(huán)境中，細(xì)胞與相鄰細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間密切接觸、相互影響，共同調(diào)控著細(xì)胞的生命活動［11－12］。目前研究者們通常使用二維培養(yǎng)條件來進(jìn)行體外細(xì)胞研究，這種平面培養(yǎng)條件與細(xì)胞生活的體內(nèi)微環(huán)境存在明顯差別，可能造成細(xì)胞生長狀態(tài)的差異［13］。本實驗借助明膠材料和谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶來構(gòu)建體外三維細(xì)胞培養(yǎng)條件，以更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞生活的微環(huán)境；本研究發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)條件下PDLSCs呈分層排列、沒有向周圍形成的突起，且細(xì)胞膜緊密地圍繞在細(xì)胞核周圍。三維條件下細(xì)胞的這種形態(tài)特征與其在二維條件下呈單層排列并向四周伸出突起樣結(jié)構(gòu)的形態(tài)存在明顯差異［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞高度聚縮的形貌有利于降低其對外界不利刺激的敏感度，提高細(xì)胞的存活率，更接近細(xì)胞在體內(nèi)的狀態(tài)［12］；一些研究也發(fā)現(xiàn)，三維支架材料中培養(yǎng)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞緊縮成圓球形，體積減小，其成軟骨分化潛能也明顯增強(qiáng)［14］。與之前的研究相似，本實驗的結(jié)果表明體外三維條件下細(xì)胞的形態(tài)和伸展情況與傳統(tǒng)的二維條件下存在明顯差異，這些變化在一定程度上可能影響細(xì)胞的生物學(xué)行為及其對外界刺激的反應(yīng)。因此，構(gòu)建合適的體外培養(yǎng)條件以模擬體內(nèi)微環(huán)境，是探索高糖環(huán)境對細(xì)胞多向分化性能影響的重要基礎(chǔ)。

良好的成骨分化潛能是牙周膜干細(xì)胞應(yīng)用于牙周組織再生的關(guān)鍵。另外大量研究表明，高血糖微環(huán)境是糖尿病引起細(xì)胞性能受損的關(guān)鍵因素［15］。因此，本實驗在三維培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建體外高糖環(huán)境，進(jìn)一步探索三維培養(yǎng)條件下高糖環(huán)境對PDLSCs成骨和成脂分化潛能的影響。結(jié)果顯示，高糖環(huán)境下細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少、成骨相關(guān)基因的表達(dá)降低，表明高糖環(huán)境下PDLSCs的成骨分化減弱；另一方面，高糖環(huán)境下PDLSCs形成的脂滴增加、成脂相關(guān)基因的表達(dá)升高，表明高糖環(huán)境下PDLSCs的成脂分化增強(qiáng)。和本研究的結(jié)果相似，有研究發(fā)現(xiàn)體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的干細(xì)胞表現(xiàn)出增殖和成骨分化潛能受損［16－17］，而成脂分化潛能增強(qiáng)［18］；但也有一些研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可促進(jìn)小鼠成骨前體細(xì)胞的成骨分化［19］。本實驗通過構(gòu)建體外三維培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可抑制PDLSCs的成骨分化并促進(jìn)其成脂分化，這些結(jié)果有望進(jìn)一步揭示高糖環(huán)境對干細(xì)胞性能的損害。

本實驗初步發(fā)現(xiàn)在體外三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞的形態(tài)特征與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)條件下具有顯著差異。進(jìn)一步證實在體外三維培養(yǎng)條件下高糖環(huán)境可抑制PDLSCs的成骨分化，而促進(jìn)其成脂分化，提示PDLSCs應(yīng)用于糖尿病人群牙周組織再生可能面臨的風(fēng)險。采用合適的策略和手段抵抗高糖環(huán)境對PDLSCs成骨分化潛能的損害，是糖尿病人群牙周組織再生的關(guān)鍵。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下細(xì)胞的 AMPK、Wnt／β-catenin等通路發(fā)生改變［20－21］。因此，關(guān)于高糖環(huán)境影響細(xì)胞性能的作用機(jī)制還有待深入研究，以期為糖尿病人群牙周組織再生策略的制訂提供參考。