劉曉嵐 周志堅 張真強 秦海洸 劉曉慶 荊雪寧 孔晉亮 宋志軍 吳紅

[摘要]目的探討如何利用腹腔引流管載體建立小鼠腹腔銅綠假單胞菌（PA）生物被膜（BF）感染的模型，為進一步研究 PA BF 體內(nèi)感染的致病性、耐藥機制及其防治提供研究平臺。方法利用臨床常用的腹腔引流管切成圓片在體外預先建立 PA BF 感染的載體，然后把載體植入小鼠的腹腔造成 BF 感染的動物模型。1 d 后評估小鼠腹腔的感染情況、細菌學和病理學的改變等。結(jié)果小鼠腹腔載體植入1 d 后取出引流管載體，可見 PAO1組載體表面有生物被膜樣結(jié)構(gòu)存在，并培養(yǎng)出銅綠假單胞菌活菌，腹腔載體周圍包裹組織呈現(xiàn)出急性炎癥改變;術后第2天， PAO1組小鼠比空白對照組小鼠體表溫度較前1 d 增高更明顯，體重較前1 d 降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。結(jié)論體外制作的腹腔引流管 PA 生物膜載體植入體內(nèi)可誘發(fā)小鼠腹腔 PA BF 感染，模擬體內(nèi)留置導管引起的 PA BF 感染的情況，對這種難治性感染的基礎研究提供了可靠的動物模型。

[關鍵詞]引流管;銅綠假單胞菌;生物被膜;模型

[中圖分類號] R378? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）07-0031-05

Establishment of a mouse model of abdominal drainage tube carrier-mediated Pseudomonas aeruginosa biofilm infection

LIU? Xiaolan??? ZHOU? Zhijian2????? ZHANG? Zhenqiang3????? QIN? Haiguang1LIU? Xiaoqing1JINGXuening1KONGJinliang4SONGZhijun5WUHong6

1. Department of Medicine， Shandong College of Traditional Chinese Medicine， Shandong， Yantai 264199， China;2. Department of General Surgery， Yidu Central Hospital of Weifang， Shandong， Qingzhou 262500， China;3. Department of Respiratory Medicine and Intensive Care Unit， Liuzhou People’s Hospital， Guangxi， Liuzhou 545006， China;4. Department of Respiratory Medicine and Intensive Care Unit， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Guangxi， Nanning 530021， China;5. Department of Clinical Microbiology， Hospital South West Jutland， University Hospital of Southern Denmark， Denmark， Esbjerg;6. Department of Clinical Microbiology， Rigshospitalet， University Hospital of Copenhagen， Denmark， Copenhagen

[Abstract] Objective To investigate how to establish a model of Pseudomonas aeruginosa （PA） biofilm （BF） infection in the mouse abdominal cavity using an abdominal drainage tube carrier， so as to provide a platform for further study of the pathogenicity， drug resistance mechanism and prevention and treatment of PA-BF infection in vivo. Methods? The carrier for PA-BF infection was established in vitro by using sliced discs of the commonly used abdominal drainage tube and then the carrier was implanted into the abdominal cavity of mice to create an animal model of BF infection.1 day later， the infection status， bacteriological and pathological changes in the abdominal cavity of micewere evaluated. Results When the drainage tube carrier was removed 1 day after implantation， BF-like structures were observed on the surface of the carrier in the PAO1 group， live PA were cultured， and acute inflammatory changes wereobserved in the surrounding tissues of the carrier in the abdominal cavity. On the second day after surgery， the mice in the PAO1 group showed a more significant increase in body surface temperature and a more significant decrease in body weight than those in the blank control group on the previous day， with statistically significant differences（P <0.05）. Conclusion The in vivo implantation of PA- BF carrier made by using an abdominal drainage tube in vitro can induce abdominal PA-BF infection in mice and simulate the situation of PA-BF infection caused by indwelling catheters in vivo ， thus providing a reliable animal model for the basic study of this refractory infection.

[Key words] Drainage tube; Pseudomonas aeruginosa; Biofilm; Model

引流管是一種臨床常用的將人體組織間或體腔中積聚的膿液、血液、滲出液等引流至體外，防止術后感染、促進愈合的一種醫(yī)療器械。臨床上常見的有胸腔引流管、腹腔引流管、腦室引流管、膽管引流管、淚道引流管、腦脊液引流管、腰椎引流管等。一般采用硅橡膠或聚氨酯等材料制成，無菌提供，一次性使用。引流管留置體內(nèi)很有可能出現(xiàn)引流管表面銅綠假單胞菌（P. aeruginosa， PA）、大腸桿菌、葡萄球菌等細菌生物被膜（biofilms， BF）感染，加重病情和疾病的復雜性，甚至影響臨床治療[1-4]。因此，如何減少或避免引流管留置引發(fā)的感染是相關臨床工作的重要課題之一。本研究在張真強等[5-7]相關實驗的基礎上進行改良，首先體外采用臨床上常用的一次性引流管切片建立穩(wěn)定 PA BF 感染的載體，然后把載體植入正常小鼠的腹腔造成 BF 感染，模擬體內(nèi)留置引流管引起的 PA BF 感染的情況，對這種難治性感染的基礎研究提供方便可靠的動物模型，有利于對相關疾病的致病特點和防治開展進一步的研究。

1材料與方法

1.1 實驗菌株

銅綠假單胞菌 PAO1野生型菌株（丹麥哥本哈根大學醫(yī)院臨床微生物科惠贈）。

1.2 載體

將臨床通常所用的一次性引流管（蘇州鑫達醫(yī)療器材有限公司）切割成小圓片（直徑約5 mm），然后高壓蒸汽滅菌。37℃恒溫搖床中培養(yǎng)PA 20 h，然后將細菌濃度調(diào)整至 OD600=0.05，24孔板每孔分別加入2.0 ml 生理鹽水和調(diào)好的菌液浸泡引流管載體，37℃恒溫培養(yǎng)20 h 后取出，用生理鹽水沖洗兩遍后備用（留樣送電鏡掃描觀察）。

1.3 主要試劑和儀器

LB 瓊脂（中國陸橋技術責任有限公司），HE 染色試劑盒（索萊寶），無水乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。掃描電子顯微鏡（SEM，捷克 TESCAN）、正置熒光相差顯微成像系統(tǒng)（OLYMPUS， BX53F）、酶標儀（美國ThermoMultiskan MK3），普析通用 T6新世紀紫外可見分光光度計（上海精密科學有限公司），生物安全柜（蘇州凈化設備有限公司， BHC-1300I-IA/B2），漩渦振蕩器儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）， SPX-3003-Ⅱ型生化恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），倍爾康非接觸式紅外體溫計（JXB-178，廣州市金鑫寶電子有限公司），臺式低溫高速離心機（5410R，德國 EPPENDOF），超低溫冰箱（Thermo 995）。

1.4 動物分組及模型建立

將16只清潔級健康雌性 KM 小鼠（18～22g）（廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號： SCXK 桂2014-0002）隨機分成空白對照組（8只）、PAO1組（8只）。標準鼠糧、自由飲水飼養(yǎng)1周。4%水合氯醛0.1 ml/10 g 腹腔麻醉，局部消毒后于左下腹打開6～8 mm 切口逐層進入腹腔，將載體用無菌生理鹽水輕輕沖洗后分別放入相應組小鼠腹腔，然后縫合切口。飼養(yǎng)1 d 后處死小鼠觀察感染情況：載體取出用連續(xù)稀釋法進行活菌計數(shù);載體周圍感染的腹腔組織按照病理學常規(guī)制作石蠟切片，HE 染色后在光學顯微鏡下觀察，分析 PA BF 體內(nèi)感染后的病理變化。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x ± s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 引流管載體掃描電鏡觀察

PAO1組載體進行掃描電鏡檢查，可見術前載體表面大量細菌附著，局部有黏附聚集結(jié)構(gòu)，見圖1。術后載體表面有 BF 樣結(jié)構(gòu)，其中有桿狀菌存在，見圖2。

2.2 腹腔留置導管載體活菌計數(shù)

PAO1組腹腔留置導管載體取出后培養(yǎng)出 PA 菌落，菌量為（5.42±0.39）lg（CFU/ml），空白對照組載體未培養(yǎng)出細菌。

2.3 腹腔載體周圍組織的病理學改變

PAO1組腹腔載體周圍組織可見明顯炎癥反應，大量中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，并有少量組織細胞變性、壞死，空白對照組腹腔載體周圍組織未見明顯炎癥反應，見圖3～4。

2.4 感染模型評估

16只小鼠全部存活并完成實驗，兩組死亡率均為0。術后小鼠精神萎靡，活動少，飲食少，其他一般情況可。術后第2天上午9時檢測發(fā)現(xiàn)小鼠體表溫度較前1 d 增高，PAO1組增高（0.84±0.39）℃，

明顯高于空白對照組的（0.30±0.14）℃，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.643， P=0.006）;而小鼠體重大多較術前降低， PAO1組降低（1.76±0.79）g，明顯高于空白對照組的（0.93±0.45）g，差異有統(tǒng)計學意義（ t=2.604， P=0.024）。解剖小鼠可見 PAO1組小鼠腹腔中有輕重不等的滲液，載體附近腸管粘連、局部膿腫形成;空白對照組腹腔內(nèi)無明顯積液及粘連，載體表面光滑，呈游離狀態(tài)，局部無膿腫形成，見圖5～6。結(jié)合以上電鏡、病理學、細菌學檢查結(jié)果，可證明腹腔引流管載體介導的 PA BF 感染模型建立成功。

3討論

在 PA BF 感染性疾病的基礎研究中，穩(wěn)定且有臨床意義的動物模型建立一直不理想，制約著這方面的研究進展[8-9]。張真強等[5]課題組建立的 PA 新西蘭兔膿胸模型成功模擬了胸腔閉式引流等造成 PA 膿胸這種院內(nèi)感染，為繼續(xù)進行 PA 在胸腔環(huán)境中的生長特性和耐藥機制的研究及治療方案的探索提供了科學的實驗基礎和理論依據(jù)。而臨床上腹腔引流管的使用更加常見，所引起的相關感染問題非常值得關注。臨床腹腔引流管主要分為治療性引流管和預防性引流管。治療性引流管主要用于感染性疾病，預防性引流管往往在外科、婦產(chǎn)科術后用來引流膿液、腸液、膽汁、血液、滲出液等，對治療有積極作用，但是這也可能是細菌附著增殖、發(fā)生感染的通道，尤其是自身抵抗力差的患者通過留置的引流管引起感染也可能加重病情，所以現(xiàn)在加速康復外科提倡盡早拔除腹腔引流管[10]。對于外科患者來說，手術部位感染（surgical? site infection， SSI）是最常見的醫(yī)院獲得性感染之一，導致發(fā)病率、病死率和醫(yī)院資源的消耗增加，其中手術部位的引流是手術部位感染的一個重要的危險因素。引流管使用時間是手術部位感染發(fā)生的獨立危險因素，超過3 d 的時間，手術部位感染則往往與引流管的使用有關，預防性腹腔引流管留置時間的延長會導致器官/空間手術部位感染風險明顯增加[11-12]。預防性腹腔引流液微生物感染種類總結(jié)發(fā)現(xiàn)，PA 感染發(fā)生率在全球范圍位于前5位，而且極易引起 BF 感染，加重治療難度[13-14]。重癥腹腔感染（intra-abdominal infection，IAI）病情復雜，多并發(fā)多器官功能障礙綜合征等，持續(xù)時間長、病死率高，臨床治療困難，常需多個學科聯(lián)合采用抗菌藥物、連續(xù)血液凈化、外科干預（微創(chuàng)經(jīng)皮穿刺引流或開腹引流，甚至腹腔開放治療）等治療才能取得良好效果[15]?？咕幬锏氖褂脴O易導致部分細菌出現(xiàn)多重耐藥、交叉耐藥甚至廣泛耐藥現(xiàn)象，耐藥菌會給臨床治療帶來嚴重威脅[16]，因此需要尋找有效治療的新策略和進一步的動物實驗來研究科學的藥理學配方。

本實驗采用臨床外科廣泛使用的一次性引流管切成圓片作為植入腹腔的載體，載體表面預先建立 PA BF 感染，然后移植到正常小鼠的腹腔內(nèi)造成感染，模擬外科腹腔留置引流管引起的PA BF 感染，感染動物模型的成功建立為這種難治性感染的后期實驗研究提供了條件，在此基礎上可以繼續(xù)觀察不同細菌感染、不同時間的病情變化，以及給予不同抗生素、中醫(yī)中藥等治療的效果。本研究已經(jīng)通過該動物模型證實感染3 d 后，lasR/rhlR基因缺陷組小鼠的腹腔炎癥反應明顯輕于 PAO1野生型組，提示 PA 群體感應系統(tǒng)的lasR、rhlR基因在 PA BF 體內(nèi)感染中發(fā)揮致病作用[17]。利用有效的動物模型開展進一步深入研究可為臨床相關感染的防治提供科學依據(jù)。

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（收稿日期：2021-03-02）