張 浩 韓書磊 陳 歡 侯宏衛(wèi) 胡清源

(國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心煙草生物學(xué)效應(yīng)重點實驗室，河南 鄭州 450001)

煙堿(C10H14N2)是煙草中最重要、含量最高的生物堿[1]，一般占煙草中生物堿總量的95%以上，是煙草及煙草制品重要的品質(zhì)要素和標(biāo)簽[2]。它是一種弱二級堿，由一個吡啶環(huán)和一個吡咯環(huán)構(gòu)成，最多能與兩個質(zhì)子結(jié)合，形成質(zhì)子化煙堿[3]。在煙草及煙草制品中，大部分煙堿都與有機酸的質(zhì)子結(jié)合，以質(zhì)子化形態(tài)存在，而游離煙堿量則比較少，其含量會隨著堿性增強而增加，圖1展示了3種形態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化[4-5]。

圖1 煙堿各形態(tài)的轉(zhuǎn)化Figure 1 Transformation of various forms of nicotine

研究表明，煙堿形態(tài)對煙草制品及其煙氣/氣溶膠理化性質(zhì)(如氣溶膠粒徑分布[6-8]、煙堿氣粒相分布[9]等)、感官效果[10]、煙堿釋放[11]、吸收[12-15]和代謝[16]等具有重要影響。從以萬寶路為代表的傳統(tǒng)卷煙加入氨等堿性物質(zhì)以調(diào)節(jié)煙氣煙堿形態(tài)到以JUUL為代表的電子煙以煙堿苯甲酸鹽等煙堿復(fù)合鹽代替純煙堿，煙堿形態(tài)的改變帶來了產(chǎn)品革命，并深刻影響著煙草科技的發(fā)展方向[17-18]。隨著煙堿鹽在電子煙等新型煙草制品中的廣泛應(yīng)用，煙草及煙草制品中游離煙堿的測定受到人們的廣泛關(guān)注。游離煙堿的測定是研究游離煙堿與質(zhì)子化煙堿理化性質(zhì)和生理效應(yīng)差異的基礎(chǔ)，是近幾年的研究熱點。煙草及煙草制品中總煙堿的測定方法比較成熟，而游離煙堿和質(zhì)子化煙堿的測定相對較少，并且尚無標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確測定煙草及煙草制品中的游離煙堿對煙草制品質(zhì)量評價和吸食品質(zhì)的控制具有重要的理論意義和實用價值。因此，歸納總結(jié)國內(nèi)外近30年的相關(guān)文獻，分析各方法的優(yōu)缺點，并對該領(lǐng)域以后的發(fā)展進行展望，旨在為不同形態(tài)煙堿相關(guān)研究應(yīng)用提供參考。

1 溶劑萃取法

目前，溶劑萃取法是測定煙草及煙草制品中游離煙堿含量相關(guān)研究最多、應(yīng)用最廣泛的一種方法。其原理是根據(jù)游離煙堿與質(zhì)子化煙堿在有機相和水相中的溶解度差異，用有機溶劑將游離煙堿萃取出來并進行檢測。根據(jù)樣品制備過程的差異，可將溶劑萃取法分為煙草/煙液和煙氣/氣溶膠兩種基質(zhì)。

1.1 煙草/煙液基質(zhì)中的測定

對于煙草/煙液基質(zhì)，樣品不需要經(jīng)過抽吸，可直接對樣品進行游離煙堿測定。對于煙草基質(zhì)，盧斌斌等[19]研究了煙葉中游離煙堿的萃取條件，與三氯甲烷振蕩萃取和三氯甲烷索式提取相比，水—三氯甲烷萃取法更接近真實值，所以確定采用水、三氯甲烷依次萃取和氣相色譜—氫火焰離子化檢測器法(GC-FID)分析煙草中游離煙堿。杜珊等[20]采用同樣的方法，同時在煙草本底中加煙堿標(biāo)樣測定游離煙堿回收率，發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果偏低?？赡苡捎跓煵葜写嬖诘娜跛崛鯄A性成分，使萃取液呈弱酸性，煙堿由游離態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)，從而導(dǎo)致回收率偏低。

除了使用GC-FID進行檢測，殷全玉等[21]在溶劑萃取后，根據(jù)煙堿在259 nm處有特征吸收，用紫外分光光度計來測定煙草游離煙堿含量。先用三氯甲烷萃取樣品中的煙堿，再用H2SO4和中性水分別萃取待測液，用紫外分光光度計測定總煙堿和質(zhì)子化煙堿量，二者之差即為游離煙堿量。李維莉等[22]雖然同樣使用紫外分光光度計進行測定，但萃取和測定方法有一定的差別，其先用水—三氯甲烷依次萃取煙樣，萃取出游離煙堿，分別測定溶液在236，259，282 nm下的吸光值，直接計算出游離煙堿量。該方法的測定結(jié)果與采用氣相色譜無顯著差異，是一種簡便有效，適用于普通實驗室操作的游離煙堿測定方法，但紫外分光光度法對煙堿的特異性相對較差，因此可能具有一定的局限性。

對于煙液基質(zhì)，El-Hellani等[23]基于“游離煙堿有選擇地從有機溶劑甲苯中提取出來”的假設(shè)，采用水和甲苯組成的溶劑體系萃取電子煙煙液中的游離煙堿。先將煙液經(jīng)水稀釋后，使用甲苯依次萃取兩次，取有機相進行氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析。李劍政等[24]使用超純水—二氯甲烷依次萃取，以超高效合相色譜—二極管陣列檢測器法(UPC2-DAD)測定電子煙煙液中的游離煙堿含量。與液相色譜法相比，超高效合相色譜作為分析手段更加快速、高效、綠色環(huán)保，但儀器普及率相對較低。Gholap等[25]研究發(fā)現(xiàn)甲苯的萃取率比正己烷高87%左右，在二次萃取后，甲苯對游離煙堿的萃取率幾乎達到98%，因此，選用甲苯作為萃取有機相，可以更好地萃取游離煙堿。但是煙液中的香精容易與甲苯相互作用，影響甲苯對煙堿的萃取。盧樂華等[26]研究發(fā)現(xiàn)，相比于正己烷和甲苯，二氯甲烷的單次萃取效率最高，疏水性和靈敏度較好，使用二氯甲烷進行萃取可以避免多次萃取所導(dǎo)致的測定結(jié)果偏差。

1.2 煙氣/氣溶膠基質(zhì)中游離煙堿的測定

對于煙氣/氣溶膠基質(zhì)，樣品需要經(jīng)過抽吸過程，捕集煙氣/氣溶膠后，才能進行后續(xù)的測定。捕集過程普遍使用劍橋濾片進行，其對卷煙主流煙氣中煙堿的捕集率在99%以上，因此，分析主流煙氣中的游離煙堿就往往轉(zhuǎn)化為分析劍橋濾片上截留的游離煙堿[27]。

在卷煙主流煙氣中的游離煙堿測定方面，盧斌斌等[28]使用三氯甲烷—中性水依次萃取劍橋濾片，取有機相進行GC-FID分析，研究發(fā)現(xiàn)，采用三氯甲烷萃取濾片上的煙堿，再用中性水反萃有機相，然后測定有機相中的游離煙堿，這樣得出的數(shù)據(jù)更接近真實值。張紅等[29]研究發(fā)現(xiàn)，中性水對煙堿形態(tài)平衡影響較小，在三氯甲烷—中性水體系中，游離煙堿幾乎全部保留在三氯甲烷中。El-Hellani等[23]研究發(fā)現(xiàn)，劍橋濾片上的堿性硅硼酸鹽會將電子煙氣溶膠中的質(zhì)子化煙堿轉(zhuǎn)化為游離態(tài)煙堿，因此，使用石英濾片捕集電子煙氣溶膠中的總粒相物，再用水—甲苯依次萃取后，取有機相進行GC-MS分析。

總之，溶劑萃取法的關(guān)鍵是樣品前處理，比較關(guān)鍵的影響因素是有機溶劑和濾片的選擇，而萃取完成后的檢測方法以GC-FID和GC-MS最為常見。有機溶劑主要有二氯甲烷[24,26]、三氯甲烷[19-22,28-29]、甲苯[23,25]等，而濾片主要包括劍橋濾片[28]和石英濾片[23]。對于萃取溶劑的選擇，不同基質(zhì)所選用有機溶劑存在差異：煙草和卷煙煙氣普遍使用三氯甲烷作為萃取溶劑，對于電子煙煙液及其氣溶膠，單次萃取時二氯甲烷的萃取效率最高[26]，而兩次萃取時選用甲苯的研究較多，但相對耗時耗力[23,25]。對于濾片的選擇，卷煙煙氣普遍使用劍橋濾片，但有研究[23]顯示，劍橋濾片中的堿性硅硼酸鹽會將電子煙氣溶膠中的質(zhì)子化煙堿轉(zhuǎn)化為游離煙堿，改變了氣溶膠中煙堿的形態(tài)，因此，石英濾片可能是更優(yōu)選擇。溶劑萃取法對試驗儀器要求較低且方法簡單且成本較低，但某些煙堿鹽既溶于水又溶于部分有機溶劑，在水中稀釋的煙液是弱酸或弱堿的混合物，根據(jù)酸堿平衡原理，在有機溶劑提取一次游離煙堿后，游離煙堿和質(zhì)子化煙堿之間的平衡可能會發(fā)生變化，產(chǎn)生更多的游離煙堿，這就使測得的游離煙堿的含量可能會比實際值偏大[30]。

2 固相微萃取法

固相微萃取技術(shù)最初應(yīng)用于環(huán)境化學(xué)分析，現(xiàn)已逐步擴展到食品、天然產(chǎn)物、臨床化學(xué)、生物化學(xué)等諸多領(lǐng)域[31]。頂空固相微萃取(HS-SPME)集萃取和濃縮為一體，適用于煙草及煙草制品中存在的各種生物堿，游離煙堿就是其中的一種[32-33]。在頂空萃取模式中，萃取過程分為兩個步驟：一是游離煙堿從液相擴散到氣相；二是游離煙堿從氣相轉(zhuǎn)移到萃取固定相[31]。

Pankow等[34]利用不同形態(tài)煙堿揮發(fā)性差異，用聚四氟乙烯氣體采樣袋收集主流煙氣，采用熱解吸法和GC-MS進行分析。但是，使用氣袋捕集主流煙氣的提取過程較為繁瑣，并且容易使目標(biāo)化合物在氣袋上沉積，這可能導(dǎo)致待測物回收率低，且方法重復(fù)性不好。Watson等[35]對Pankow的方法進行改進，用劍橋濾片代替氣體采樣袋捕集主流煙氣粒相物，放入20 mL瓶中，平衡后，用固相微萃取纖維提取頂空中的游離煙堿，并用GC-MS進行定量分析。Bao等[36]在試驗中先用玻璃纖維濾片收集卷煙主流煙氣粒相物，將濾片分成兩半，一半用于測定水分和總煙堿量，另一半用HS-SPME分析游離煙堿含量，發(fā)現(xiàn)通過水分校正因子可以減少水分含量對測試結(jié)果的影響。Tang等[37]建立了頂空固相微萃取—氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用直接定量分析煙葉中游離煙堿的方法，該方法將單個樣品0.2 g加入20 mL瓶中，加入2 μL內(nèi)標(biāo)溶液，密封后在30 ℃下放置至少2 h，然后進行頂空萃取，GC-MS分析。研究了樣品形態(tài)、固相微粒纖維類型、預(yù)平衡溫度、預(yù)平衡時間、萃取溫度和萃取時間等分析方法的最佳條件。

HS-SPME法具有樣品處理簡單、無溶劑對樣品的干擾、測定過程簡單、結(jié)果準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，適用于煙草或煙氣中游離煙堿含量測定[37]。但是HS-SPME技術(shù)基于粒相物、頂空和固相微萃取纖維中游離煙堿濃度之間的平衡，鑒于游離煙堿的極性、半揮發(fā)性和酸堿性質(zhì)，平衡溫度、基質(zhì)成分(如水)、及萃取纖維的類型、預(yù)平衡時間、萃取時間等對測定精密度和準(zhǔn)確度都有顯著影響，需深入考察操作條件和樣品基體效應(yīng)，并對操作條件進行規(guī)范[36,38]。

3 1H NMR法

核磁共振是鑒定有機化合物結(jié)構(gòu)的一種重要手段，可以提供化學(xué)位移δ、偶合常數(shù)J和各種核的信號強度比3種信息。游離煙堿與質(zhì)子化煙堿的核磁共振氫譜信息略有不同，根據(jù)游離煙堿與質(zhì)子化煙堿中氫化學(xué)位移的不同，可以得出不同類型樣品中游離煙堿的含量信息[39]。由圖2可知，與游離煙堿相比，質(zhì)子化煙堿的氫化學(xué)位移顯著增大，樣品中游離煙堿比例可根據(jù)不同形態(tài)煙堿He與芳香族質(zhì)子Ha～Hd化學(xué)位移的差異計算得出(見圖2)。

A. 加入1倍摩爾比叔丁胺的電子煙煙液 B. 未添加酸或堿的電子煙煙液 C. 加入5倍摩爾比醋酸的電子煙煙液圖2 1,2-丙二醇和丙三醇配制的電子煙煙液中煙堿氫的化學(xué)位移隨酸堿添加而發(fā)生變化的1H NMR譜圖[40]Figure 2 1H NMR spectra showing the chemical shift changes for nicotine in a propylene glycol + glycerol (PG + GL) stock mixture with the addition of acid and base, independently

Pankow等[41]使用1H NMR的方法分析了一種高甘油加熱卷煙(Eclipse)氣溶膠中的游離煙堿，研究發(fā)現(xiàn)甘油含量高使得無需添加溶劑即可獲得清晰的圖譜，但是對于傳統(tǒng)卷煙、雪茄等產(chǎn)生的煙氣粒相物，這種方法還需要進一步開發(fā)。Barsanti等[39]研究發(fā)現(xiàn)在分析游離煙堿含量時，卷煙煙氣粒相物的黏度對圖譜的獲取會產(chǎn)生一定影響，在升溫至40 ℃，并用氘代二甲基亞砜溶解時，能夠得到更清晰的圖譜，1H NMR技術(shù)在表征卷煙煙氣粒相物中的游離煙堿方面有重要潛力。

Dell等[40]采用1H NMR法測定電子煙煙液中的游離煙堿，將電子煙煙液樣品放入精密核磁共振插件中，氘代二甲基亞砜作為鎖定溶劑放入核磁共振管中。使用TXI探針，在40 ℃下運行，以增加分子翻滾速率，從而改善墊片。施加ZG 30脈沖，收集16次掃描，弛豫延遲3 s，實際光譜大小65 536，譜寬9 000 Hz，激發(fā)偏置3 600 Hz，總試驗時間為2 min。該研究使用了600 MHz的核磁共振系統(tǒng)，但也有可能適用于更低場的核磁共振儀。通過比較游離煙堿和質(zhì)子化煙堿標(biāo)準(zhǔn)的甲基和芳香族質(zhì)子在甘油/丙二醇和商用電子煙煙液之間的相對化學(xué)位移差異，計算游離煙堿比例。然而，由于煙堿芳香族質(zhì)子的Δδ不一致，可能是由于乙酸與煙堿的吡啶氮形成了絡(luò)合物，用該方法計算的加熱卷煙(IQOS)氣溶膠的δ值不準(zhǔn)確。因此，Meehan-Atrash等[42]在采用1H NMR法直接測定加熱卷煙(IQOS)氣溶膠中的游離煙堿時，用煙堿甲基質(zhì)子的絕對化學(xué)位移計算游離煙堿比例，同時采用HS-SPME對1H NMR的測定結(jié)果進行驗證。研究結(jié)果表明，IQOS氣溶膠中幾乎不存在游離煙堿，并且1H NMR法與HS-SPME測定結(jié)果差別不大。

1H NMR法一般用于電子煙煙液、氣溶膠和煙氣中游離煙堿測定，優(yōu)點是在測定電子煙煙液中的游離煙堿時不需要對其進行稀釋，可以有效避免外加溶劑對樣品產(chǎn)生影響，同時減少萃取所需時間，更方便、快捷。但是，對于煙氣或氣溶膠基質(zhì)，需要對捕集的粒相物進行稀釋，這樣就失去了1H NMR法不改變樣品的優(yōu)勢[30,41]。并且電子煙煙液是幾種化學(xué)物質(zhì)的混合物，考慮到分析的復(fù)雜性，需要對煙堿—CH3峰與調(diào)味劑峰的重疊、選擇性、分辨率、測定限等參數(shù)進行詳細的測試[25]。因此，雖然1H NMR法的前景看好，但仍需進一步研究以解決這些問題。

4 Henderson-Hasselbalch法

Morie[43]提出根據(jù)酸堿平衡理論來計算在不同pH時煙氣中游離煙堿與質(zhì)子化煙堿的比例。計算結(jié)果顯示，只有當(dāng)pH>6.0時，煙堿才能以游離態(tài)存在；pH>7.4時，游離煙堿比例上升至30%；pH>7.8時，游離煙堿的比例為50%左右，而實際混合型卷煙煙氣的pH大約在5.2～6.2，計算得到的游離煙堿含量在0.22%～2.17%[3]。

美國疾病控制預(yù)防中心(USCDC)所建立的Henderson-Hasselbalch法(HH法)，將煙草提取液或電子煙煙液用定量水稀釋，測定pH和總煙堿，根據(jù)25 ℃下煙堿在純水中的解離常數(shù)pKa代入方程，計算出游離煙堿比例[44]。這種方法已經(jīng)應(yīng)用到很多研究中，可以簡單地計算出游離煙堿的比例，它給出了游離煙堿測量的相對標(biāo)度[45]。Richter等[44,46-47]采用HH方程法測定無煙氣煙草中的游離煙堿含量，通過測定無煙氣煙草和去離子水混合的pH、總煙堿和pKa值，將其代入HH方程[見式(1)]來計算游離態(tài)煙堿與質(zhì)子化煙堿的比例。

(1)

HH法可以快速測定游離煙堿含量，在無煙氣煙草的游離煙堿測定中應(yīng)用較為廣泛，但是其游離煙堿的測定結(jié)果也受到少數(shù)學(xué)者的質(zhì)疑。因為HH方程只在單一堿及其共軛酸的純稀水溶液中有效，正確使用HH方程來估算煙草制品提取物中的游離煙堿，要求煙草提取物中不存在其他酸、堿和鹽，這在大多數(shù)情況下顯然是不存在的[46]。萃取液中的離子強度會影響溶液pH，而溫度等則會影響煙堿的解離常數(shù)，這些都會對方程計算的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響[46]。同時煙草制品中含有多種調(diào)味劑，這些調(diào)味劑有可能會改變萃取液的酸堿性，從而使pH不能準(zhǔn)確預(yù)測游離煙堿的比例[25]。并且關(guān)于煙氣pH的測定，現(xiàn)在并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同測定方法的測定結(jié)果各不相同，通過pH計算出的游離煙堿含量也會產(chǎn)生差異[48]。

5 光譜法

光譜法是近年來發(fā)展的用于測定電子煙煙液中游離煙堿含量的方法，該方法是基于顯色分子選擇性地與游離煙堿反應(yīng)顯色的原理，指示體系中的游離煙堿含量，曾用于測定煙草中的煙堿含量[49]。

黃延俊等[50]通過在電子煙煙液中加入水溶性指示劑茜素紅S(ARS)來測定游離煙堿含量。由于ARS的酸度比有機酸低，不與有機酸競爭叔胺，只能與游離煙堿相互作用，在其兒茶酚羥基去質(zhì)子化后，ARS從淡黃色變?yōu)榉奂t色，并且測得ARS與煙堿的結(jié)合常數(shù)為1.08×106L/mol，游離煙堿的含量可以通過測定吸收光譜來實現(xiàn)。黃延俊等[51]選取與ARS結(jié)構(gòu)相似但吸電子能力不同的溴甲酚綠(BCG)和氯酚紅(CPR)，比較不同顯色分子與煙堿的親和性對電子煙煙液游離煙堿測定結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)，光譜法與1H NMR法具有較好的相關(guān)性，并且CPR比BCG更適合作為指示劑。

光譜法可以更加方便快捷地測定電子煙煙液中的游離煙堿，減少了萃取游離煙堿的過程，只需要對電子煙煙液進行稀釋，但是避免不了外加溶液對原溶液的影響。同時電子煙煙液中有機酸或其他酸性成分的不同是否會影響顯色分子與游離煙堿的結(jié)合等問題，還需要進一步探究。

綜上，游離煙堿測定方法的研究見表1。

表1 煙草及煙草制品中游離煙堿測定方法總結(jié)?Table 1 Summery of determination methods of free-base nicotine in tobacco and tobacco products

6 總結(jié)與展望

近年來，雖然關(guān)于游離煙堿的分析測定方法的研究已經(jīng)取得一定的進展，但這幾種方法都有各自的優(yōu)勢和局限性：① 溶劑萃取法目前應(yīng)用較多，成本低，但是操作繁瑣耗時較長，并且外加溶劑容易導(dǎo)致酸堿平衡的變化，影響測定的準(zhǔn)確性；② 固相微萃取法主要應(yīng)用于煙氣或氣溶膠中，不需要外加溶劑從而可以反映真實狀態(tài)，但是在操作過程中影響因素較多，需要嚴(yán)格控制相關(guān)試驗條件；③1H NMR法可以直接測定游離煙堿，方便、快捷，但會存在基質(zhì)干擾，并且儀器成本較高，普適性較差；④ HH法通過總煙堿含量和pH來計算游離煙堿含量，但是這種方法存在一定誤差，而且準(zhǔn)確測定煙草和煙氣/氣溶膠pH也是一大難題；⑤ 光譜法可以避免萃取產(chǎn)生的誤差，但是稀釋劑和指示劑都可能影響原溶液的酸堿平衡，亦會產(chǎn)生測試誤差。

隨著越來越多樣品前處理和檢測方法的出現(xiàn)，測定煙草及煙草制品中游離煙堿的含量方法可以有更多的選擇，但是，如何在不改變原有狀態(tài)或?qū)υ瓲顟B(tài)影響可以忽略的情況下，高效、低成本地準(zhǔn)確測定游離煙堿含量是今后的研究方向。