韓夢瑤 李新月 王曉梅 王國治 葉金云 張忠山

(1. 水生動物繁育與營養(yǎng)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000；2. 浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000；3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動物繁育與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000；4. 湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

中國水域遼闊，水產(chǎn)資源豐富，其中淡水養(yǎng)殖占水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的75%。魚類在加工和消費(fèi)過程中會產(chǎn)生約50%的下腳料，包含魚皮、魚尾、魚骨、魚鰭、魚鱗等[1]，這些下腳料不僅會對環(huán)境造成污染，同時也是一種資源的浪費(fèi)。大口黑鱸(Micropterussalmoides)俗稱加州鱸，原產(chǎn)于北美洲，于20世紀(jì)80年代被引入中國養(yǎng)殖[2]，目前已成為中國養(yǎng)殖的主要淡水魚種之一[3]。

膠原蛋白是結(jié)締組織的重要組成部分，是一種白色、不透明、無支鏈的纖維狀蛋白質(zhì)，主要存在于動物的皮、骨、牙齒、韌帶和血管中，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的作用[4]，目前膠原蛋白的提取方法主要有酸法[5]、酶法[6]、堿法[7]、熱水法[8]等。膠原蛋白肽是膠原蛋白的酶解產(chǎn)物，一般由3～20個氨基酸組成[9]，具有抗氧化、降血脂、提高免疫力等生物活性[10]。因其分子量小，溶解性好，易被人體腸道吸收，目前在保健食品、化妝品中得到廣泛應(yīng)用[11-12]。

人體內(nèi)含有多種自由基，自由基會引起機(jī)體發(fā)生病變和衰老，甚至引起癌癥。目前，研究人員[13-15]已從鱈魚(Theragrachalcogramma)、鮟鱇魚(Lophiuslitulon)、羅非魚(Oreochromismossambicus)等魚皮中得到了具有抗氧化活性的多肽，證實(shí)了從水產(chǎn)動物中提取的多肽具有良好的抗氧化活性，擁有較好的發(fā)展前景。大口黑鱸近年來在浙江省的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量增長非常迅速，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的歡迎，但在深加工過程中會產(chǎn)生大量魚皮副產(chǎn)物，其富含膠原蛋白，可作為提取膠原蛋白的原料。但目前對大口黑鱸魚皮多肽的提取及其抗氧化活性報(bào)道較少。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大口黑鱸魚皮：湖州市海鮮市場；

30%雙氧水、硫酸亞鐵、硫酸銅、磷酸鈉、鉬酸銨、水楊酸、鐵氰化鉀、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

堿性蛋白酶(20萬U/g)、中性蛋白酶(10萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g)、胰蛋白酶(25萬U/g)：上海源葉生物有限公司；

乙腈、三氟乙酸：色譜純，美國Sigma公司。

試驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

冷凍高速離心機(jī)：TG16KR型，長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-P(Ⅲ)型，杭州庚雨儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-1200 型，南京菲勒儀器有限公司；

質(zhì)譜儀：AutoflexⅢ型，日本島津儀器有限公司；

電泳儀：POWER 300型，萊普特儀器科學(xué)儀器公司；

冷凍干燥機(jī)：SJIA-10N型，寧波市雙嘉儀器有限公司；

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：BGZX-9076MBE型，廣州航信科學(xué)儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-S24型，無錫沃信儀器制造有限公司；

電子天平：AR224CN型，廣州市怡華新電子儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大口黑鱸魚皮膠原蛋白的制備 魚皮清洗后烘干，剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，加入0.5 mol/L碳酸鈉溶液攪拌浸泡24 h，脫去雜蛋白和色素，用蒸餾水沖洗至pH 7，晾干。按m魚皮∶V10%異丙醇為1∶10 (g/mL)的比例混合攪拌浸泡24 h進(jìn)行脫脂處理，蒸餾水洗凈，晾干；將除雜后的魚皮按照料液比(m魚皮∶V乙酸) 1∶100 (g/mL)的比例加入含有0.3%胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸中攪拌浸泡24 h，4 000 r/min離心10 min，上清液緩慢加入氯化鈉鹽析24 h，4 000 r/min離心10 min，沉淀用乙酸復(fù)溶，蒸餾水透析，真空冷凍干燥得到大口黑鱸魚皮膠原蛋白。

1.2.2 不同酶解膠原肽的制備 稱取大口黑鱸魚皮膠原蛋白1 g，按照料液比(m魚皮膠原蛋白∶V乙酸)1∶100 (g/mL)的比例，加入0.5 mol/L 乙酸溶解，得到膠原蛋白溶液。分成4份，向其中加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶，并調(diào)節(jié)膠原蛋白溶液pH在各酶的最適pH范圍內(nèi)(表1)，最適溫度下酶解4 h，100 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫后離心(4 000 r/min，10 min)，取上清分別得到堿性蛋白酶酶解膠原蛋白肽(APP)、中性蛋白酶酶解膠原蛋白肽(NPP)、木瓜蛋白酶酶解膠原蛋白肽(PP)、胰蛋白酶酶解膠原蛋白肽(TP)。

表1 4種蛋白酶的最適pH、溫度Table 1 Optimal pH and temperature for 4 kinds of proteases

1.2.3 膠原蛋白及膠原蛋白肽分子量測定

(1) 膠原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳：根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：稱取5 mg膠原蛋白溶于1 mL 5% SDS溶液，85 ℃變性1 h，冷卻至室溫，5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。配制8%的分離膠和4%的濃縮膠，加入20 μL 的蛋白樣品和高分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，在電泳槽中加入電泳緩沖液，電泳結(jié)束后，加入考馬斯亮藍(lán)R-250染液染色4 h，回收染色液，加入乙酸—甲醇脫色液，數(shù)小時更換一次脫色液，直至背景清晰，放入凝膠成像儀進(jìn)行觀察。

(2) 大口黑鱸魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜：根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改如下：將大口黑鱸魚皮膠原蛋白用0.5 mol/L乙酸配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，用紫外分光光度計(jì)在波長范圍400～200 nm掃描。

(3) 質(zhì)譜儀測定膠原蛋白肽分子量：根據(jù)文獻(xiàn)[18]修改如下：設(shè)定波長λ=337 nm，加速電壓25 kV。乙腈和超純水1∶1混合(含0.1%三氟乙酸)作為溶劑使用，將APP、NPP、PP、TP溶解于溶劑中，配成1 mg/mL的溶液。樣品和基質(zhì)溶液1∶1 (g/mL)混合，取1 μL點(diǎn)在靶板上，自然干燥后，將樣品板放進(jìn)儀器中進(jìn)行測定。

1.2.4 水解度測定 采用茚三酮法[19]，按式(1)計(jì)算膠原蛋白肽的蛋白水解度(DH)。

(1)

式中：

d——水解度，%；

N1——蛋白酶水解后氨基態(tài)氮含量，μmol/L；

N2——原料中游離氨基態(tài)氮含量，μmol/L；

N0——原料中總游離氨基態(tài)氮含量，μmol/L。

1.2.5 膠原蛋白肽抗氧化活性研究

(1) 總抗氧化能力：采用鉬酸銨法[20]，酶解膠原蛋白肽與鉬酸銨溶液反應(yīng)，于695 nm進(jìn)行比色，吸光度代表各管總抗氧化能力。

(2) 還原能力：采用鐵氰化鉀還原法[21]，以pH 6.6磷酸鹽緩沖液代替樣品作為空白對照，測定各管OD值，繪制還原能力曲線。

(3) 清除DPPH·活性：根據(jù)文獻(xiàn)[22]，按式(2)計(jì)算DPPH·清除率。

(2)

式中：

η——自由基清除率，%；

A0——對照管OD值；

A1——加入膠原蛋白肽的OD值。

(4) 清除·OH活性：采用水楊酸法[23]，以3 mmol/L 水楊酸溶液進(jìn)行調(diào)零，于510 nm下測吸光度，按式(2)計(jì)算膠原蛋白肽對·OH的清除率。

(3)

式中：

A0——加入Tris-HCl緩沖液的OD值；

A1——加入膠原蛋白肽的OD值。

(6) 亞鐵離子螯合能力：根據(jù)文獻(xiàn)[25]，按式(4)計(jì)算膠原肽的亞鐵離子螯合能力。

(4)

式中：

η——亞鐵離子螯合率，%；

A0——對照管OD值；

A1——加入膠原蛋白肽的OD值。

(7) 脂質(zhì)氧化抑制活性：根據(jù)文獻(xiàn)[26]修改如下：將0.5 mL酶解膠原蛋白肽與2.5 mL 2.5%亞油酸無水乙醇、2 mL磷酸鹽緩沖液混合，吸取0.0～0.1 mL混合液，用75%乙醇補(bǔ)足至5 mL，隨后加入30%硫氰酸銨溶液0.1 mL，20 mmol/L FeCl20.05 mL，準(zhǔn)確計(jì)時3 min，在500 nm處測定吸光度，并用蒸餾水代替FeCl2作為空白管調(diào)零，按式(5)計(jì)算膠原蛋白肽脂質(zhì)氧化抑制率。

(5)

式中：

η——脂質(zhì)氧化抑制率，%；

A0——對照管OD值；

A1——加入膠原蛋白肽的OD值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Graphpad Prism 9對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白及膠原蛋白肽分子量

2.1.1 膠原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳 由圖1可知，大口黑鱸魚皮膠原蛋白主要由兩條120 kDa的α鏈和一條200 kDa的β鏈組成，符合Ⅰ型膠原蛋白的特征。Ⅰ型膠原蛋白是魚皮和魚鱗中發(fā)現(xiàn)的主要膠原蛋白，主要由兩條α鏈和一條β鏈組成[16]。β鏈?zhǔn)铅伶湹亩垠w，表明Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)完整，胃蛋白酶未破壞膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，與周瑞等[6]研究結(jié)果保持一致。圖1中，在α2條帶以下，無其他明顯的條帶，表明提取的大口黑鱸魚皮膠原蛋白純度較高，三螺旋結(jié)構(gòu)保持完好。

圖1 大口黑鱸魚皮膠原蛋白SDS-PAGE圖Figure 1 SDS-PAGE image of Micropterus salmoidesskin collagen

圖2 大口黑鱸魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜Figure 2 Ultraviolet absorption of collagen fromMicropterus salmoides skin

2.1.3 不同蛋白酶酶解膠原肽質(zhì)譜圖 由圖3～圖6可知，APP、NPP、PP、TP的相對分子質(zhì)量分別集中在110～1 942，200～1 883，112～1 943，120～1 951 Da。不同的蛋白酶具有不同的酶切位點(diǎn)，從而使得APP、NPP、PP、TP氨基酸組成和序列發(fā)生變化，相對分子質(zhì)量出現(xiàn)差異。研究[29]表明，分子量越小，抗氧化活性越高，更易被人體吸收。

圖3 APP質(zhì)譜圖Figure 3 APP mass spectrum

圖4 NPP質(zhì)譜圖Figure 4 NPP mass spectrum

圖5 PP質(zhì)譜圖Figure 5 PP mass spectrum

圖6 TP質(zhì)譜圖Figure 6 TP mass spectrum

2.1.4 不同蛋白酶酶解膠原肽氨基酸的相對百分含量

如表2所示，APP、NPP和PP都含有12種氨基酸，而TP僅含有11種氨基酸。氨基酸的種類、數(shù)量及排列順序與多肽抗氧化能力有著緊密聯(lián)系。研究[30]表明，酸性氨基酸(Asp、Glu)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp)、含硫基氨基酸(Met、Cys)和疏水性氨基酸具有較強(qiáng)的抗氧化能力。試驗(yàn)中APP所含有的抗氧化氨基酸種類和含量較為豐富，因此推斷APP具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

表2 不同蛋白酶酶解膠原肽氨基酸的相對百分含量Table 2 The relative percentages of amino acids in collagen peptides hydrolyzed by different proteases %

2.2 酶種類對膠原蛋白水解度的影響

蛋白質(zhì)通過酶解，生成的小分子肽更易被人體吸收。通過測定其水解度，可以了解不同蛋白酶的酶解程度。由圖7可知，堿性蛋白酶的酶解效果最好(P<0.05)，其水解度可以達(dá)到25.44%，其他3種蛋白酶的酶解效果相差不大，與胡楊等[31]研究結(jié)果一致。結(jié)合質(zhì)譜圖可知，水解度越大，肽鍵斷裂更徹底，分子量越小。

圖7 不同蛋白酶的水解效果比較Figure 7 Comparison of hydrolysis effects of different proteases

2.3 大口黑鱸魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化能力 由圖8可知，4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽都具有總抗氧化能力，并且隨濃度的增加呈上升趨勢，其中APP總抗氧化能力明顯優(yōu)于其他3種蛋白酶酶解膠原蛋白肽。這可能與其水解度有關(guān)，堿性蛋白酶水解度最高，肽鍵斷裂更徹底，更有利用水解出抗氧化氨基酸，提高膠原蛋白肽的抗氧化活性[32]。

2.3.2 還原能力 由圖9可知，4種蛋白酶酶解膠原肽都具有還原能力，但APP還原能力明顯優(yōu)于其他3種蛋白酶酶解膠原蛋白肽(P<0.05)，當(dāng)APP質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，吸光度達(dá)到0.958，優(yōu)于鮟鱇魚皮膠原蛋白肽[27](還原能力為0.676)?？偪寡趸芰瓦€原能力之間具有明顯的正相關(guān)性，由圖8和圖9可知，抗氧化和還原能力依次為APP>NPP>PP>TP。結(jié)果表明，大口黑鱸魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性與其濃度和酶解液的水解度密切相關(guān)。

圖8 不同酶解膠原蛋白肽總抗氧化能力Figure 8 Total antioxidant capacity of collagen peptides hydrolyzed by different enzymes

圖9 不同酶解膠原蛋白肽還原能力Figure 9 Different enzyme hydrolyzed collagen peptide reduction ability

2.3.3 清除DPPH·活性 由圖10可知，質(zhì)量濃度為0.25～2.00 mg/mL時，TP清除DPPH·能力并未隨著其質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.50 mg/mL時，清除率明顯上升，原因可能是設(shè)定濃度還未達(dá)到其合適濃度。而其他3種蛋白酶酶解膠原蛋白肽清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TP，當(dāng)APP質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時，DPPH·清除率已達(dá)到最大值56.35%。可以看出，在相同濃度下，APP具有較強(qiáng)的DPPH·清除率。原因可能是堿性蛋白酶是一種深入的內(nèi)切蛋白酶，能夠切除多種肽鍵，釋放出活性肽段，更有利于清除自由基，提高抗氧化能力。

圖10 不同酶解膠原蛋白肽DPPH·清除率Figure 10 DPPH free radical scavenging rate of different enzymatically hydrolyzed collagen peptides

2.3.4 清除·OH活性 由圖11可知，質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL 時，PP的·OH清除率無顯著變化，僅為3.5%，其他3種蛋白酶酶解膠原蛋白肽清除率已達(dá)到55%～67%，原因可能是未達(dá)到PP的合適濃度。APP質(zhì)量濃度在2～4 mg/mL時，清除率從31.55%升高到67.05%，顯著高于PP(P<0.05)；在質(zhì)量濃度為4 mg/mL 后，清除率呈平緩的趨勢，表示已達(dá)到最大清除率。與大菱鲆魚皮膠原蛋白肽[11]相比，APP對·OH的清除能力更強(qiáng)。

圖11 不同酶解膠原蛋白肽·OH清除率Figure 11 Hydroxyl radical scavenging rate of different enzymatic collagen peptides

圖12 不同酶解膠原蛋白肽清除率Figure 12 Scavenging rate of superoxide anion free radicals of different enzymatic collagen peptides

2.3.6 亞鐵離子螯合能力 由圖13可知，在膠原蛋白肽質(zhì)量濃度為0.125～0.250 mg/mL時，APP亞鐵離子螯合能力增加趨勢最為明顯。從清除率趨勢來看，APP亞鐵離子螯合能力最強(qiáng)，與楊雅蘭等[33]研究結(jié)果一致?？赡芘c堿性蛋白酶水解度最高有關(guān)，堿性蛋白酶具有最強(qiáng)的剪切力，通過水解使其釋放出更多的活性肽段和氨基酸，從而與亞鐵離子進(jìn)行螯合。

圖13 不同酶解膠原蛋白肽亞鐵離子螯合能力Figure 13 Different enzyme-hydrolyzed collagen peptides with ferrous ion chelating ability

2.3.7 脂質(zhì)氧化抑制活性 由圖14可知，4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽對脂質(zhì)氧化都具有很高的抑制活性，抑制率可以達(dá)到99%。脂質(zhì)氧化生成的醛與糖尿病、阿爾茲海默癥等疾病密切相關(guān)[34]，而膠原蛋白肽可以有效抑制脂質(zhì)氧化，預(yù)防疾病的發(fā)生。

圖14 不同酶解膠原蛋白肽脂質(zhì)氧化抑制活性Figure 14 Different enzyme hydrolyzed collagen peptides lipid oxidation inhibitory activity

3 結(jié)論

通過SDS-PAGE凝膠電泳證實(shí)了從大口黑鱸魚皮中提取的膠原蛋白為Ⅰ型膠原蛋白，含有3條鏈，分別為兩條120 kDa的α鏈和一條200 kDa的β鏈。采用酸酶復(fù)合法提取大口黑鱸魚皮膠原蛋白不僅可以提高效率和得率，而且可以保持膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)利用4種蛋白酶酶解大口黑鱸魚皮膠原蛋白，結(jié)果表明，4種蛋白酶酶解膠原蛋白肽均具有抗氧化能力，且抗氧化能力和膠原蛋白肽濃度、水解度都呈一定的正相關(guān)關(guān)系。水解度越大，分子量越小，抗氧化活性越高。蛋白酶的種類對膠原蛋白肽具有一定的影響，有可能是不同酶類具有不同的酶切位點(diǎn)，酶解成不同分子量和氨基酸組成的膠原蛋白肽，從而產(chǎn)生不同的抗氧化活性。4種蛋白酶中，堿性蛋白酶具有最高的水解度和抗氧化活性。