劉春燕 丁 捷 鄧尚貴 秦 文 劉 艷

(1. 浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；3. 四川旅游學(xué)院食品學(xué)院，四川 成都 610100)

四川省是中國主要的藍(lán)莓鮮果供應(yīng)地，2020年的總產(chǎn)量為5.0萬t，位居全國第二[1]。藍(lán)莓采后極易被病原真菌侵入造成腐爛發(fā)霉，分離鑒定藍(lán)莓采后致腐的主要病原真菌是防治的關(guān)鍵，但侵染藍(lán)莓致腐的病原真菌地域差異性較大。遼寧地區(qū)的病原真菌主要是灰葡萄孢、鏈格孢、青霉、粉紅單端孢菌和產(chǎn)黃青霉[2-3]；浙江杭州的主要致腐病原真菌為灰葡萄孢、木霉和青霉[4]；貴州麻江縣的采后腐爛病原真菌為間座殼屬、鏈孢霉、球黑孢霉、內(nèi)生真菌和灰霉菌[5]。目前尚未見四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌的研究報(bào)道。

化學(xué)試劑殺菌是防治果實(shí)采后真菌性病害的主要途徑，但頻繁和高濃度的使用會(huì)造成環(huán)境和食品污染，還易誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性[6]，因此尋找安全高效的天然抗菌劑成為當(dāng)務(wù)之急。王丹等[7-8]發(fā)現(xiàn)植物精油對果實(shí)采后病原菌的抑制效果較好。但植物精油中有效成分含量及生理活性受多種因素影響，其抑菌穩(wěn)定性較差[9]。因此，精油成分對常見采后病原真菌的抑制逐漸成為研究熱點(diǎn)[10-12]。目前已有香茅醇、丁香酚及麝香草酚等多種精油組分的相關(guān)報(bào)道[9,13]。研究擬以四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓在低溫貯藏期的病果為試材，分離純化病原真菌，并以優(yōu)勢病原真菌為目標(biāo)菌株，篩選具有廣譜抑菌效果的精油成分，以期為藍(lán)莓采后病害防治和新型抑菌藥劑研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 原料及處理

藍(lán)莓(VacciniumSpp.)：采自四川省的14個(gè)商業(yè)種植基地，采摘后當(dāng)日冷鏈運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除殘次、病蟲害及機(jī)械損傷的果實(shí)，挑選成熟度、顏色、大小基本一致的藍(lán)莓為試材，于(2.0±0.5) ℃，RH 85%機(jī)械冷庫中貯藏備用。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

萬分之一電子天平：FA2204B型，上海佑科儀器儀表有限公司；

高壓滅菌鍋：GI54DS型，廈門致微儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH-250F型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱：LHS-250型，鄭州生元有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2D型，武漢一恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司；

顯微鏡：E100型，日本Nikon公司；

乙醇：分析純，成都科隆化學(xué)試劑公司；

姜酮(97%)、香茅醇(95%)、丁香酚(99%)、D-檸檬烯(95%)、桉葉素(80%)、香芹酮(95%)、莰烯(75%)、月桂烯(90%)、松油醇(98%)、松油烯(95%)、麝香草酚(98%)、β-蒎烯(98%)、二烯丙基硫醚(98%)、肉桂醛(98%)、香芹酚(99%)：分析純，羅恩試劑上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 藍(lán)莓貯藏病原真菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法分離病原真菌。取果實(shí)病原交界處的組織(5 mm×5 mm)，分別用75%酒精和0.1%升汞處理30 s，無菌水沖洗后接種至PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃ 培養(yǎng)48 h。挑取菌落邊緣純化3～5代，保存斜面?zhèn)溆?。選擇疑似病原真菌菌株，以有傷接種和無傷接種兩種方式進(jìn)行驗(yàn)證。以接種空白菌餅的為對照組，將培養(yǎng)皿置于25 ℃、RH 90%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。觀察記錄發(fā)病情況，按照柯赫氏法則，驗(yàn)證藍(lán)莓貯藏疑似病原真菌的致病性。

1.4 病原真菌形態(tài)特征觀察及分子鑒定

將病原真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察記錄單菌落形態(tài)和菌絲孢子結(jié)構(gòu)特征，參照真菌形態(tài)學(xué)鑒定手冊進(jìn)行分類鑒定。

采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對純化病原真菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序，利用SnapGene軟件處理測序結(jié)果。將病原真菌序列和NCBI進(jìn)行Blast比對，選取與病原真菌同源性高和形態(tài)相似的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 溫度和光照對藍(lán)莓采后優(yōu)勢及亞優(yōu)勢病原真菌菌絲生長的影響

采用點(diǎn)植法接種病原真菌，培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，分析環(huán)境溫度(5，10，15，20，25，28，30，32，35，38 ℃)和光照條件(24 h全光照、12 h光暗交替的半光照和24 h全黑暗)對菌絲生長的影響。

1.6 基于信息熵法初篩具有廣譜抑菌活性的精油成分

以四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓采后主要病原真菌為目標(biāo)菌株，將供試精油成分用無水乙醇配制成有效質(zhì)量濃度100 mg/L 的含藥PDA培養(yǎng)基，采用點(diǎn)植法接種病原真菌。在28 ℃ 下培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，根據(jù)相對抑制率，用信息熵法綜合評判精油組分的抑菌率。按式(1)計(jì)算菌絲生長相對抑制率。

(1)

式中：

R——相對抑制率，%；

A1——對照組直徑，mm；

A2——處理組直徑，mm。

1.7 麝香草酚對藍(lán)莓采后優(yōu)勢及亞優(yōu)勢病原真菌的體內(nèi)外抑菌活性

分別設(shè)置麝香草酚不同質(zhì)量濃度(0，20，40，60，80，100，120，150 mg/L)的帶藥平板，采用點(diǎn)植法接種后置于28 ℃避光倒置培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算相對抑菌率。參考Aspera-Werz等[14]的方法使用AAT BioQuest的EC50計(jì)算器工具(https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator)，計(jì)算麝香草酚對不同菌株的半數(shù)有效濃度(EC50)。以無菌水處理為對照，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

將Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25分別在PDA上培養(yǎng)5 d后制備1×107CFU/mL混合孢子懸浮液，噴灑到果子表面后晾干備用。以空白處理為對照，根據(jù)麝香草酚對不同菌株的半數(shù)有效濃度，將不同質(zhì)量濃度(10，30，50，70 mg/L)的麝香草酚-1%吐溫80水溶液噴施于已接種的藍(lán)莓果實(shí)表面，分別標(biāo)記為W10、W30、W50、W70。自然晾干后裝入經(jīng)75%酒精滅菌的塑料盒[(125±10) g/盒]，置于(2.0±0.5) ℃條件下貯藏，間隔2 d 監(jiān)測藍(lán)莓果實(shí)的發(fā)病情況。

Ir=n/N×100%，

(2)

式中：

Ir——發(fā)病率，%；

n——發(fā)病果子數(shù)量；

N——總的果子數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓采后發(fā)病情況調(diào)查

藍(lán)莓果實(shí)在低溫貯藏14 d后開始長霉腐爛，典型發(fā)病果實(shí)癥狀主要分為軟潰腐爛(Q1型)、果蒂長毛腐敗(Q2型)和青霉病(Q3型)3大類，其中Q1型軟潰腐爛癥狀最為常見。Q1型病果表現(xiàn)為果實(shí)表皮上密生黑色粒狀霉層，后期形成水漬狀塌陷腐敗區(qū)，果皮明顯變薄且組織崩潰，果肉全部變紅或褐變。Q2型病果主要是果蒂長毛腐爛，果蒂表層凸起絮狀白色或灰色菌絲，與周圍病果形成片狀的霉層，后期菌絲滋生處果皮組織崩潰，果肉部分變紅或褐變，伴有軟糊狀汁液滲出。Q3型病果在初期果蒂周圍形成白色霉層，后期產(chǎn)生大量孢子，在果實(shí)表面形成致密狀的青色或灰綠色霉層，感染處扁平或塌陷，果肉發(fā)生一定程度褐變，靠近果皮部位的果肉變紅。

2.2 藍(lán)莓采后病原真菌的分離頻率及致病性

由表1可知，Q1W1是四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓采后病原真菌優(yōu)勢種，其分離頻率為32.63%；Q2W22、Q3W25、Q2W19和Q3W7是亞優(yōu)勢種，分離頻率>10%。Q1W11、Q2W13、Q2W20和Q2W26是第三大優(yōu)勢種群，分離頻率<5%。由致病返接試驗(yàn)可知，上述菌株均為藍(lán)莓采后致病菌，其反接致病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似，且有傷接種的病害程度強(qiáng)于無傷接種，而對照組未見發(fā)病。在有傷接種條件下，優(yōu)勢種和亞優(yōu)勢種的發(fā)病率無顯著差異(P>0.05)，Q1W1、Q2W19和Q2W22返接5 d后果實(shí)發(fā)病率為100%，Q3W7和Q3W25的發(fā)病率分別為92.59%和88.89%；而在無傷接種條件下，Q1W1、Q2W19和Q2W22的發(fā)病率均超過50%，其中Q1W1最高(62.96%)。綜上所述，Q1W1是四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓低溫貯藏期分離頻率和發(fā)病率最高，且傳染性最強(qiáng)的采后病原真菌，其發(fā)病癥狀同黑曲霉在棗果中的報(bào)道一致[15]，故暫將其在藍(lán)莓上引發(fā)的癥狀稱為藍(lán)莓采后黑霉病。

表1 四川產(chǎn)區(qū)采后病原真菌相對分離頻率和致病性?Table 1 Relative isolation frequency and pathogenicity of postharvest pathogens in Sichuan

2.3 藍(lán)莓采后病原真菌的形態(tài)學(xué)特征

從發(fā)病果實(shí)病原交界處分離得到95株真菌，根據(jù)菌落形態(tài)和孢子形態(tài)初步分為9種，如圖1所示。

圖1 藍(lán)莓采后病原真菌的菌株形態(tài)、孢子形態(tài)和回接癥狀Figure 1 Morphological characteristics of isolated strains and their symptoms after reconnection with blueberries

Q1W1和Q1W11菌落平坦而整齊，氣生菌絲為白色短絨狀，孢子在48 h后產(chǎn)生，但Q1W11的孢子更質(zhì)密；顯微鏡下兩株菌株的分生孢子頭均為球形且菌絲光滑，無隔膜和分支，可初步判定為曲霉屬。

Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22和Q2W26的菌落均呈絨毛狀，菌絲為白色或者褐色，其中Q2W13需要在無菌松針(馬尾松)的水瓊脂培養(yǎng)基上才能產(chǎn)孢[16]；Q2W19在培養(yǎng)8 d后開始產(chǎn)孢。顯微鏡下的菌絲均細(xì)長；Q2W19的分生孢子呈燒瓶形，含5個(gè)細(xì)胞，具有4個(gè)分隔，頂端和基部各有附屬絲2，1根；Q2W22的分生孢子呈倒棒狀，有橫隔；Q2W26的孢子梗頂端著生球形孢子囊，分生孢子為近球形或橢圓形。根據(jù)病原真菌的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合參考文獻(xiàn)[17]，將Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22和Q2W26初步鑒定為小新殼梭孢菌、類擬盤多毛孢屬、禾谷鐮刀菌、鏈鉻孢屬、毛霉屬。其中鏈鉻孢在東北和華東地區(qū)的藍(lán)莓采后病原真菌中有相關(guān)報(bào)道。

Q3W7和Q3W25的菌落均呈地毯狀，其中Q3W7菌落較平坦，而Q3W25菌落表面褶皺且營養(yǎng)菌絲深入培養(yǎng)基內(nèi)部。在顯微鏡下Q3W7的分生孢子梗形如掃帚，分生孢子呈球形；而Q3W25的分子孢子頂生或側(cè)生，形成短鏈，呈橢球型。根據(jù)病原真菌的形態(tài)學(xué)特征結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[2,18]，Q3W7和Q3W25初步鑒定為青霉屬、枝孢菌屬。青霉和枝孢菌主要是中國西南產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓采后的病原真菌。

2.4 藍(lán)莓采后病原真菌的分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，Q1W1和Q1W11分別和曲霉屬中AspergillusnigerATCC16888，AspergillustubingensisNRRL 4875的親緣關(guān)系比較接近，結(jié)合菌落形態(tài)分別鑒定為黑曲霉、塔賓曲霉菌。Q2W13、Q2W19、Q2W20、Q2W22、Q2W26分別與NeofusicoccumparvumstrainWZ-92、Neopestalotiopsissp.isolate2177、FusariumgraminearumisolateNRRL28302、AlternariaalternataisolateUASB8、MucorfragilisstrainLMSA 1.09.161的親緣關(guān)系比較接近，結(jié)合菌落形態(tài)分別鑒定為小新殼梭孢菌、類擬盤多毛孢菌、禾谷鐮刀菌、互生鏈鉻孢菌和毛霉。Q3W7、Q3W25分別與Penicilliumsp.SAF6-EGY、CladosporiumxylophilumisolateFR1801的親緣關(guān)系接近，結(jié)合菌落形態(tài)分別鑒定為噬木枝狀枝孢菌、青霉菌。

圖2 藍(lán)莓采后病原真菌的系統(tǒng)發(fā)育Figure 2 Phylogenetic tree of postharvest pathogens of blueberry

2.5 溫度和光照對藍(lán)莓采后優(yōu)勢及亞優(yōu)勢病原真菌菌絲生長的影響

由圖3可知，溫度和光照對不同病原真菌菌絲生長的影響存在較大區(qū)別。Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的菌落直徑均隨溫度的升高呈先增加后降低的趨勢；其中Q2W22的生長溫度范圍最廣，在10～38 ℃的范圍內(nèi)均能生長；Q3W25的生長溫度范圍最小為15～30 ℃。根據(jù)菌落大小，Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的最適生長溫度分別為35，20，30，30，25 ℃。Q1W1、Q2W19和Q3W25最適宜光照條件為12 h光暗交替，Q2W22的最適宜光照是24 h光照，而Q3W7菌株的菌絲生長情況與培養(yǎng)期間光照時(shí)長無顯著相關(guān)性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 溫度和光照對藍(lán)莓采后病原真菌生長的影響Figure 3 Temperature and light on the growth of postharvest pathogenic fungi of blueberry

2.6 基于信息熵法初篩具有廣譜抑菌活性的植物精油成分

將15種精油成分對藍(lán)莓采后優(yōu)勢菌株的5 d生長抑制率通過信息熵重新確定權(quán)重系數(shù)，Q1W1、Q2W19、Q2W22、Q3W7和Q3W25的權(quán)重系數(shù)分別為0.364 158，-0.127 020，-0.009 360，0.536 662，0.235 562。根據(jù)式(3)計(jì)算綜合抑制率，其值越大說明該精油成分的廣譜抑菌效果越好。由表2可知，麝香草酚的綜合抑制率最高為100%，其次是香芹酚(63.77%)、二烯丙基硫醚(36.20%)、肉桂醛(30.75%)、β-蒎烯(22.01%)和香茅醇(18.39%)，其余9種精油成分的綜合抑制率均小于5%。

F=0.364 158R1-0.127 020R2-0.009 360R3+0.536 662R4+0.235 562R5，

(3)

式中：

F——綜合抑制率，%；

R1、R2、R3、R4、R5——Q1W1、Q3W7、Q2W19、Q2W22和Q3W25菌絲的相對抑制率，%。

2.7 麝香草酚對藍(lán)莓采后優(yōu)勢和亞優(yōu)勢病原真菌體內(nèi)外抑菌活性

麝香草酚對藍(lán)莓采后優(yōu)勢和亞優(yōu)勢病原真菌體內(nèi)外抑菌活性見圖4。由圖4(a)可知，Thymol對Q2W22的抑制活性最小，EC50為(55.33±8.03) mg/L，顯著高于其他菌株；而Q2W19、Q3W25、Q3W7和Q1W1的室內(nèi)毒力無顯著差異，其EC50分別為(29.80±3.65)，(31.98±2.07)，(35.35±7.42)，(38.18±7.56) mg/L。前人研究發(fā)現(xiàn)以麝香草酚為主要成分的百里香精油對鏈鉻孢的EC50為18.456 μL/L[8]，肉桂—山蒼子復(fù)合精油對黑曲霉的最小抑菌濃度為0.125 μL/mL[19]，均小于麝香草酚對中黑曲霉的EC50(38.18 mg/L)及鏈鉻孢的EC50(55.33 mg/L)。這可能是由于精油是多種抑菌物質(zhì)混合物，因此抑菌效果優(yōu)于單一組分麝香草酚。但植物精油中的醇類、醛類和烯類物質(zhì)因其原料來源和提取工藝差異性較大，對特定抑菌活性的貢獻(xiàn)度是不確定、不穩(wěn)定的[20]，因此極大限制了植物精油采后處理效果的穩(wěn)定性。

由圖4(b)可知，在整個(gè)常溫貯藏期間，所有麝香草酚處理組的采后病害發(fā)病率均低于CK，均能有效控制真菌病害。W10組的發(fā)病率在4～8 d內(nèi)顯著低于同期的其他組。而W50和W70的發(fā)病率在常溫貯藏4 d后急劇增加，分別為50.69%和53.90%，而W10僅從16.24%增加到31.92%。這可能是由于麝香草酚具有高植物毒性[21]，超過50 mg/L的施用濃度可能導(dǎo)致果實(shí)嚴(yán)重藥害。

3 結(jié)論

以低溫貯藏下自然發(fā)病的四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓為試材，共分離得到95株真菌，其中Aspergillusniger、Neopestalotiopsissp.、Alternariaalternat、Penicilliumsp.和Cladosporiumxylophilum是四川產(chǎn)區(qū)藍(lán)莓采后的主要病原真菌。這5株菌的最適生長溫度分別為35，20，30，30，25 ℃，其中Penicilliumsp.對光照反應(yīng)不敏感，而其他菌株敏感。麝香草酚對上述5株菌的抑制效果較好，其半數(shù)有效濃度范圍為30～50 mg/L。研究還發(fā)現(xiàn)麝香草酚水溶液的施用濃度和實(shí)際采后病害防治的應(yīng)用效果不呈正比。因此較低濃度的麝香草酚水溶液具有防治藍(lán)莓采后病害的潛力，可在未來作為廣譜抑真菌成分研發(fā)高效安全的新型采后緩釋抑菌劑。