孫海燕 郝丹青 李新生,2 金文剛

(1. 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2. 陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心秦巴地區(qū)保鮮工作站，陜西 漢中 723000；4. 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 漢中 723000；5. 陜西理工大學(xué)秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室〔培育〕，陜西 漢中 723000)

天麻又名定風(fēng)草、神草、赤箭、獨搖芝等，在中國云南、貴州、陜西、湖北、四川等地被廣泛栽培[1-2]。2020年1月2日，國家衛(wèi)健委、國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布《關(guān)于對黨參等9種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點工作的通知》中，將天麻、黨參等9種物質(zhì)列入藥食同源物質(zhì)生產(chǎn)經(jīng)營試點中，這一決定有望刺激和帶動中國天麻產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，尤其鮮天麻的相關(guān)研究。

鮮天麻自身具有特殊的香味，不同品種、采收期的天麻香氣濃郁程度有所區(qū)別。目前測定天麻中揮發(fā)性香氣物質(zhì)成分普遍采用電子鼻、氣質(zhì)色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。氣相—離子遷移色譜(GC-IMS)法結(jié)合了氣相色譜高分離度和離子遷移譜高靈敏度的優(yōu)勢，無需任何特殊的樣品前處理，即可快速檢測樣品中的痕量揮發(fā)性有機物[3]，該儀器已被廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味分析[4-5]、真?zhèn)舞b別[6-7]和新鮮度分析[8]中，也可用于非法藥物的痕量檢測[9]及人呼出氣體揮發(fā)性有機化合物[10-11]和人類皮膚釋放揮發(fā)性化合物[12-13]的監(jiān)測和疾病判別[14-15]中等。但在鮮天麻揮發(fā)性物質(zhì)測定中未見氣相色譜—離子遷移譜聯(lián)用(GC-IMS)技術(shù)的相關(guān)研究報道。研究擬利用GC-IMS技術(shù)對6個產(chǎn)地、3個品種的鮮天麻揮發(fā)性物質(zhì)成分進行測定分析，以期為后續(xù)鮮天麻的快速分類區(qū)分提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

天麻(如表1所示)：采收時間集中在11～12月份，種植時間約10個月。當(dāng)天采挖后，低溫迅速郵寄實驗室進行揮發(fā)性物質(zhì)測定。

表1 天麻品種產(chǎn)地Table 1 Variety and origin of Gastrodia elata

1.1.2 儀器

氣相色譜—離子遷移色譜：FlvourSpec型，德國GAS公司。

1.2 樣品處理

取新鮮天麻，洗去表面泥沙與附著的蜜環(huán)菌，切成盡量小的碎末，取7 g天麻樣品，置于20 mL頂空進樣瓶中密封，頂空進樣。每種樣品重復(fù)測定3次。

1.3 GC-IMS條件

1.3.1 氣相—離子遷移譜單元 分析時間20 min，色譜柱類型MXT-5，15 mL，0.53 mm內(nèi)徑(ID)，1 μm膜厚(FT)，柱溫60 ℃，IMS溫度45 ℃，載氣/漂移氣為N2。

1.3.2 自動頂空進樣單元 孵育溫度60 ℃，孵育時間15 min 后進樣，進樣體積500 μL，進樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

1.3.3 氣相色譜條件 如表2所示。

表2 氣相色譜條件[15]Table 2 Chromatographic conditions

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用儀器配套的分析軟件，包括VOCal和Reporter、Gallery Plot和Dynamic PCA三款插件及“最近鄰”指紋分析，分別從不同角度進行樣品分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中揮發(fā)性物質(zhì)成分對比

利用Reporter插件制作鮮天麻中揮發(fā)性有機物質(zhì)的二維俯視圖(見圖1)，紅色的RIP峰兩邊不同顏色的小點代表檢測到的不同的揮發(fā)性有機物。不同顏色代表鮮天麻中檢測到的不同揮發(fā)性物質(zhì)的濃度不同，其中白色表示檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)濃度較低，紅色表示檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)濃度較高，而且顏色越深表示該揮發(fā)性物質(zhì)的濃度越大。其背景顏色為藍色，橫坐標(biāo)1.0處的紅色豎線即為圖1中的RIP峰(反應(yīng)離子峰，經(jīng)歸一化處理)，根據(jù)峰兩側(cè)點的顏色有無或者深淺可以闡明不同鮮天麻樣品之間的揮發(fā)性物質(zhì)組分及濃度的差異。

由圖1和圖2可以看出，烏天麻所含揮發(fā)性物質(zhì)種類和濃度明顯比紅天麻多，而相同品種之間鮮天麻的揮發(fā)性物質(zhì)種類和濃度之間相差不大。說明天麻品種對揮發(fā)性物質(zhì)的檢測結(jié)果起主要作用，而且烏天麻的揮發(fā)性物質(zhì)種類和濃度較紅天麻多和高，也從側(cè)面說明烏天麻品質(zhì)更優(yōu)。

圖1 鮮天麻中揮發(fā)性有機物的成分譜圖Figure 1 Spectrum of volatile components in fresh Gastrodia elata BI

圖2 鮮天麻中揮發(fā)性有機物的成分對比差異圖譜Figure 2 Comparative difference spectrum of volatile components in fresh Gastrodia elata BI

2.2 鮮天麻中揮發(fā)性物質(zhì)Gallery Plot指紋譜圖

繪制不同鮮天麻樣品的Gallery Plot指紋圖譜，如圖3 所示。

橫行代表一個鮮天麻樣品中的不同揮發(fā)性物質(zhì)成分；豎列代表檢測到的某種揮發(fā)性物質(zhì)在不同鮮天麻樣品中的信號峰強度；每一個信號峰的顏色明暗代表該物質(zhì)的濃度高低，紅色代表該揮發(fā)性物質(zhì)含量較高，白色代表含量低；數(shù)字表示未知物圖3 鮮天麻的Gallery Plot指紋圖譜Figure 3 Gallery plot fingerprint of fresh Gastrodia elata BI

由圖3可以看出，3種烏天麻所含揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量均明顯高于紅天麻和雜交天麻，其中T3云南烏天麻中苯甲醛、苯乙醛、丙烯酸正丁酯、正己醇、異戊酸、丙酸和苯乙稀含量最高，比較典型特色的揮發(fā)性物質(zhì)為丙烯酸正丁酯、丙酸和未知物24，這3種揮發(fā)性物質(zhì)在其他鮮天麻中基本檢測不到，即便在T2貴州烏天麻中有檢出，但檢測到的濃度極低；T7湖北烏天麻中反式E-2-己烯醛、E-2-辛烯醛、E-2-庚烯醛、己醛、異戊酸甲酯、2-丁酮、1-辛烯-3-醇、1-戊醇和2-正戊基呋喃等物質(zhì)含量最高，比較典型特色的揮發(fā)性物質(zhì)為(E)-2-庚烯醛；T1貴州紅天麻中揮發(fā)性物質(zhì)種類和濃度均優(yōu)于其他紅天麻，其中庚醛、辛醛、壬醛、己醛、乙酸乙酯、甲酸乙酯、異丙醇、丁醇和己酸等物質(zhì)含量最高；T2貴州烏天麻中比較典型的揮發(fā)性物質(zhì)為未知物1、2和25；T4湖北紅天麻中相對典型的物質(zhì)為4-甲基-2-戊酮；T8甘肅紅天麻樣品中的典型香氣物質(zhì)為β-蒎烯，甘肅紅天麻中含量最高，在T4湖北紅天麻和T5商洛雜交天麻樣品中也含有，但含量非常低，而在其他鮮天麻樣品中未檢測到；在T6漢中紅天麻中也檢測到了其特有的揮發(fā)性物質(zhì)，即未知物16，該揮發(fā)性物質(zhì)僅在漢中紅天麻中存在，而在其他鮮天麻中未檢測到。

2.3 主成分分析

降維后進行主成分分析，其結(jié)果見圖4。不同顏色代表不同產(chǎn)地或品種的鮮天麻，不同點的遠近代表相似性高低，相同點的離散程度代表相同樣品的均一性。由圖4可知，紅天麻和烏天麻之間各自具有一定聚集區(qū)域，說明兩個品種鮮天麻之間的特征差異較為明顯。而相同品種不同產(chǎn)地的樣本之間的特征差異也比較明顯，平行測試聚集更為緊密，而樣本間的距離較遠。

圖4 樣品PCA分析Figure 4 PCA analysis

由圖4還可以看出，第一主成分貢獻率35%，第二主成分貢獻率24%，第一、二主成分總貢獻率59%。T2貴州烏天麻、T3云南烏天麻和T7湖北烏天麻分散在一側(cè)，說明3種烏天麻具有相似性，且T2貴州烏天麻和T3云南烏天麻聚集度較高，說明這兩個產(chǎn)地采集的天麻相似性更好，且3個產(chǎn)地鮮天麻的均一性均較好。T1貴州紅天麻、T4湖北紅天麻、T5商洛雜交天麻、T6漢中紅天麻和T8甘肅紅天麻聚集度較好，說明相似性較高，而T5商洛雜交天麻介于T6漢中紅天麻和T8甘肅紅天麻之間，且與T8甘肅紅天麻相似性更高，說明T5商洛雜交天麻的品性更接近紅天麻，而與烏天麻相似性較差。不同產(chǎn)地的鮮天麻，其聚集比較分散，而相同品種的鮮天麻聚集性更高，說明影響聚類的主要因素是鮮天麻品種，而地域不是影響鮮天麻香氣的主因。

2.4 聚類分析

樣品間歐氏距離圖見圖5。通過歐式距離，可以更直接對所有樣本進行辨別區(qū)分，可以看出T2貴州烏天麻和T3云南烏天麻之間以及T6漢中紅天麻和T8甘肅紅天麻之間的距離較近，相似度高，而T5商洛雜交天麻與T6漢中紅天麻和T8甘肅紅天麻之間相似度均較高。也進一步證實T2貴州烏天麻和T3云南烏天麻相似性更高，T6漢中紅天麻和T8甘肅紅天麻相似性更高；T5商洛雜交天麻與紅天麻相似性較烏天麻而言更高。這與主成分分析結(jié)果一致。其原因可能是：① 兩個地域的相同品種天麻本身就很接近；② 當(dāng)?shù)胤N植的天麻購于另一個地方，由于種植環(huán)境、海拔等的不同，導(dǎo)致天麻香氣有所差異，但差異不大，因此不同地域同一個品種鮮天麻的相似性較高。

圖5 樣品間歐氏距離圖Figure 5 Euclidean distance graph

2.5 鮮天麻中揮發(fā)性有機物定性分析

由圖6可以看出，鮮天麻中共檢測到75種揮發(fā)性物質(zhì)及其具體分布的相應(yīng)位置，其中點越大、越紅說明相應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)濃度越高，即(E)-2-庚烯醛-M、苯甲醛、苯乙醛、戊醛-D、(E)-2-庚烯醛、正己醛-D、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯-M、異丙醇-D和甲酸乙酯-D是鮮天麻中最主要的揮發(fā)性物質(zhì)成分。

圖6 Library Search定性分析Figure 6 Qualitative analysis

由表3可以看出，鮮天麻中共檢出75種揮發(fā)性化合物，其中可以鑒定出的物質(zhì)有45種，其中，醛類物質(zhì)檢出數(shù)量最多，共16種，占所有已知物質(zhì)的35.6%；其次是酯類，共9種，占所有已知物質(zhì)的20%，與醛類物質(zhì)總和超50%；醇類6種；酮類檢出5種；酸類物質(zhì)檢出3種，未知化合物共檢出有30種，曹森等[16]利用電子鼻和GC-MS對貴州畢節(jié)烏天麻的芳香品質(zhì)進行測定，發(fā)現(xiàn)烷烴類、芳香成分、硫化物和菇烯類對天麻香氣的貢獻率較大，可達81.42%；利用GC-MS對3個不同采收時間的天麻香氣成分進行鑒定，其中第一采收期的天麻香氣成分總數(shù)為40種，第二采收期的42種，第三采收期的36種，總香氣成分65種，其中共有成分19種，主要為醇類、酯類、酮類、酸類、醛類、酚類、烷烴類等；測定的香氣種類類型與試驗結(jié)果類似，但測定檢出的天麻中揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量要比試驗少10種。黃名正等[17]以貴州天麻干燥塊莖為試材，利用超臨界CO2萃取天麻中揮發(fā)性成分，結(jié)合GC-MS進行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天麻油中共分離鑒定出30種揮發(fā)性成分，主要為醛類、酚類、酯類、植醇類、有機酸類、烷烴和烯烴類等，尤以有機酸類占比最大；雖然測定的揮發(fā)性物質(zhì)類型比試驗多，但得到的天麻揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量要少50%以上，可能與試驗材料有關(guān)。采用不同的儀器對天麻揮發(fā)性成分進行分析測定，影響因素除與天麻材料本身有關(guān)外，也與所選儀器有很大關(guān)系，其中電子鼻測定的是大的揮發(fā)性物質(zhì)種類，而不能測定分析出具體是哪種物質(zhì)；GC-MS是全范圍測定，易揮發(fā)性物質(zhì)、半揮發(fā)性物質(zhì)和難揮發(fā)性物質(zhì)均可測定，而GC-IMS主要測定易揮發(fā)性物質(zhì)，而且檢測的限值較GC-MS更低，更靈敏，可以捕捉檢測到更多痕量有機物，在試驗測定時，需要根據(jù)實際情況具體選擇，也可多儀器結(jié)合測定，結(jié)果更全面。在該試驗中有近50%的物質(zhì)數(shù)據(jù)庫中無法檢測到，后期需要結(jié)合質(zhì)譜、核磁共振等測定結(jié)果進一步分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而確定其具體物質(zhì)名稱。

表3 鮮天麻中揮發(fā)性化合物定性分析列表Table 3 Qualitative analysis of volatile compounds in fresh Gastrodia elata BI

3 結(jié)論

(1) 紅天麻和烏天麻之間的特征差異比產(chǎn)地之間更為明顯，說明通過揮發(fā)性物質(zhì)成分的測定可以區(qū)別鮮天麻的品種，因此該方法更適合進行鮮天麻品種的區(qū)分鑒定，而不適用于產(chǎn)地之間的區(qū)分。

(2) 商洛烏紅雜交天麻與甘肅紅天麻之間相似度最高，而與烏天麻相似性較差。

(3) 該方法能夠定性出鮮天麻中的75種揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)，其中醛類物質(zhì)檢出數(shù)量最多，共16種，其次為酯類、醇類等，尤以(E)-2-庚烯醛-M、苯甲醛、苯乙醛、戊醛-D、(E)-2-庚烯醛、正己醛-D、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯-M、異丙醇-D和甲酸乙酯-D在鮮天麻中濃度高；有30種未定性物質(zhì)，還需結(jié)合質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)進一步進行分析。