田 星 葉慧潔 劉石峰 歐陽瑤力

(1. 湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2. 湖南省康德佳林業(yè)科技有限責任公司，湖南 永州 425600)

菊花為菊科菊屬宿根性草本植物，除觀賞外，還有藥用及食用價值[1]。菊花含有豐富的多酚類、黃酮類、三萜類、揮發(fā)油類和有機酸類等，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤以及抗炎等藥理作用[2]。而作為獨特的花茶保健飲品，大部分菊花都是以茶飲的形式被消費，但是菊花茶有澀味，而無法滿足消費者的口腔愉悅感，導(dǎo)致單純的菊花茶產(chǎn)品市場認可度偏低。一些生產(chǎn)商為了減弱、掩蓋其澀味，在菊花茶飲中加入白砂糖等甜味劑矯味，這也一定程度上影響了消費者的感官體驗感。

多酚類物質(zhì)是食品中主要的呈澀物質(zhì)[3]，此外，金屬鹽類的多價陽離子、具有高等電點的堿性蛋白以及殼聚糖等物質(zhì)也能產(chǎn)生澀味[4]。呈澀物質(zhì)與唾液蛋白相互作用導(dǎo)致蛋白沉淀，口腔中的潤滑感減少而產(chǎn)生澀感。近年來，不少學者對于澀感產(chǎn)生的潛在機制提出了不同的假設(shè)，如唾液膜破裂、唾液潤滑減少、受體(機械和化學受體)感受到的機械感知和組織的收縮[5]。Chen等[6]認為口腔被一層唾液膜覆蓋、潤滑，口腔加工某些食物和飲料會使其受損。唾液膜分為兩層，一層是動態(tài)的、容易移除的；另一層是與上皮細胞共價連接的。唾液膜的破壞會使細胞表面和受體暴露，導(dǎo)致表面疏水性增高，摩擦增加，產(chǎn)生澀味[7-8]。Gibbins等[9]研究認為呈澀化合物與唾液作用會引起口腔表面性質(zhì)、流變性和潤滑性的改變。目前，澀味感知的研究方法主要包括感官評價等直接檢驗、SDS-PAGE凝膠電泳試驗等唾液復(fù)合物的間接檢驗、生物摩擦學評估以及分子動力學模擬等[10]。而評價菊花茶澀味特征評價主要采用感官評定的方法，這種方法更適合對菊花茶整體滋味特征評價，但不能量化評價每一種滋味的呈味強度。

研究擬以不同品種的菊花(皇菊、金絲皇菊、杭白菊、亳菊、貢菊)為研究對象，分析其水提物中總多酚、總黃酮、綠原酸含量，通過電子舌智能味覺分析系統(tǒng)及傳統(tǒng)感官評定確定其主要澀味成分，并利用SDS-PAGE凝膠電泳法等探究呈澀物質(zhì)與唾液的相互作用，以期為菊花茶的脫澀，提高消費者的感官體驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金絲皇菊、皇菊：湖南省康德佳林業(yè)科技有限責任公司；

杭白菊：杭州巨佳茶葉有限公司；

亳菊、貢菊：安徽常富國藥有限公司；

SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司；

總蛋白測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；

Bradford蛋白濃度測定試劑盒：福州飛凈(Phygene)生物科技有限公司；

沒食子酸標準品：上海麥克林生化科技有限公司；

蘆丁標準品、綠原酸標準品：江西佰草源生物科技有限公司；

α-淀粉酶：5萬U/g，上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳儀：JY300C型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；

高效液相色譜儀：1260 Infinity II型，安捷倫科技有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1780型，島津儀器(蘇州)有限公司；

熒光分光光度計：F16Pro型，上海棱光技術(shù)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52C型，鞏義市中天儀器科技有限公司；

酶標儀：FC型，美國賽默飛世爾科技公司；

pH計：STARTER3100型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

電導(dǎo)率儀：STARTER 3100C/F型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

凝膠成像分析系統(tǒng)：Universal HoodⅡ型，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 不同品種菊花水提物的制備 取適量皇菊、金絲皇菊、杭白菊、亳菊、貢菊，用粉碎機研磨成粉末，準確稱取菊花各(3.00±0.01) g于250 mL圓底燒瓶中，按m菊花粉∶V水=1∶40 (g/mL)加入蒸餾水，于90 ℃的恒溫水浴鍋中提取40 min，所得浸提液在5 000 r/min條件下離心5 min，并在65 ℃條件下減壓濃縮1 h，溶液冷凍干燥，所得提取物粉末于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總多酚含量測定

(1) 標準曲線繪制：準確稱取0.005 g沒食子酸標準品，加少量蒸餾水溶解，定容至100 mL，分別吸取0，1，2，3，4，5 mL于試管中，加入蒸餾水至總體積為5 mL，混勻，加入福林酚試劑1 mL，靜置1 min，加入10% Na2CO3溶液8 mL，用蒸餾水補足至25 mL，暗反應(yīng)2 h，準確吸取5 mL，用蒸餾水稀釋成10 mL，以試劑空白為對照，在760 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制總多酚含量標準曲線，得回歸方程[11-12]。

(2) 樣本測定：準確稱取0.01 g的菊花樣本水提物粉末，加蒸餾水溶解并定容至10 mL，分別取1 mL于試管中，按照標準曲線的方法測定吸光度。

1.3.3 總黃酮含量測定

(1) 標準曲線的繪制：精密稱取蘆丁對照品5 mg于25 mL容量瓶中，加少許70%乙醇，超聲溶解，靜置冷卻至室溫，用70%乙醇定容，精密量取對照品溶液l，2，3，4，5，6 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至總體積為6 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，加入10 mL 10%氫氧化鈉溶液，再加70%乙醇至刻度，搖勻，靜置15 min，以試劑空白為對照，于510 nm下進行檢測。以對照品濃度C為縱坐標，吸光度A為橫坐標，繪制總黃酮含量標準曲線，得回歸方程[13]。

(2) 樣本測定：準確稱取0.01 g的樣本提取物，加少量70%乙醇，超聲處理使其溶解并用70%的乙醇定容至10 mL，按照標準曲線的方法測定吸光度。

1.3.4 菊花澀味特征分析

(1) 味覺特征值：準確稱取樣本2.00 g，加入150 mL沸水沖泡30 min，沖泡好的茶湯經(jīng)雙層紗布過濾，待其冷卻至室溫即得待測樣品，用電子舌測定其澀味和澀味后感。

(2) 澀味感官評價：參照GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓與管理評價員一般導(dǎo)則 第1部分：優(yōu)先評價員》中所述方法，通過差別檢驗(兩點法篩選)，篩選出10名感官評價員(3名男生，7名女生)組成感官評定小組。稱取不同品種菊花各(2.00±0.01) g，加入150 mL沸水沖泡30 min，沖泡好的茶湯經(jīng)雙層紗布過濾，即得待測樣品。感官評價員對每個樣本的澀味指標采用五分制評分標準進行感官評分。參與感官前，評價員不得吃任何除水以外的食物，每名感官評價員單獨進行評分，評定過程中相互之間不接觸交流，各樣品之間用清水漱口。

1.3.5 唾液與茶湯相互作用

(1) 唾液收集：稱取不同品種菊花各(3.00±0.01) g，加入150 mL沸水，沖泡30 min，經(jīng)感官評定篩選出的10名受試者分別飲用5個樣品菊花茶(50 mL)，并在咽下后收集受試者的唾液。品嘗完一個樣品需用清水漱口，休息約2 min后開始品嘗下一個樣品(飲用了皇菊后收集的唾液樣品標記為S1，飲用了金絲皇菊后收集的唾液標記為S2，飲用了杭白菊后收集的唾液標記為S3，飲用了亳菊后收集的唾液標記為S4，飲用了貢菊后收集的唾液標記為S5)。飲用菊花茶樣品前先用清水漱口，并收集各受試者未飲用菊花茶前的唾液作為空白對照(標記為S0)。將收集的各受試者的唾液樣本混合均勻，10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

(2) pH值測定：參照GB/T 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》中的玻璃電極法。

(3) 電導(dǎo)率測定：將唾液樣本在4 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液后用電導(dǎo)率儀測定。

(4) 總蛋白測定：采用總蛋白測定試劑盒(BCA法)測定。

(5) SDS-PAGE凝膠電泳分析：上層膠配方為2.92 mL ddH2O、1.37 mL 4×上層膠緩沖液、0.74 mL 30% Acr-Bis、50 μL 10% 過硫酸銨、5 μL TEMED；下層膠配方為3.4 mL ddH2O、2.5 mL 4×下層膠緩沖液、4.0 mL 30% Acr-Bis、100 μL 10%過硫酸銨、4 μL TEMED。取10 μL唾液樣本和10 μL的2×上樣緩沖液混合均勻，取10 μL混合液上樣，進行電泳分析。電壓為150 V。

(6) 唾液淀粉酶沉淀指數(shù)測定：參照文獻[14]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 每個樣本進行3次重復(fù)試驗，并采用SPSS 25.0軟件(美國IBM公司)進行方差分析，P<0.05表示存在顯著性差異，反之則表示差異不顯著；采用Excel 2016(美國微軟公司)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花主要呈澀味化學成分含量

由表1可知，5種不同品種的菊花中總黃酮含量由高到低依次為：皇菊、亳菊、金絲皇菊、杭白菊、貢菊。除貢菊和杭白菊之外，不同菊花之間總黃酮含量有著顯著性的差異(P<0.05)。總體上來說，皇菊和亳菊的總黃酮含量明顯高于其他3種菊花，且皇菊明顯高于亳菊。5種菊花中總多酚含量由高到低為亳菊>皇菊>金絲皇菊>貢菊>杭白菊。不同菊花之間總多酚含量存在顯著性差異(P<0.05)，但皇菊、亳菊和金絲皇菊的含量明顯高于其他兩種菊花，且亳菊與皇菊的總多酚含量無顯著差異。5種菊花中綠原酸含量由高到低依次為：亳菊、皇菊、貢菊、金絲皇菊和杭白菊。除杭白菊和金絲皇菊外，不同菊花之間綠原酸含量有顯著性差異(P<0.05)，且亳菊和皇菊的含量明顯高于其他3種菊花。綜上，5種菊花中，皇菊和亳菊中呈澀味的主要化學成分含量明顯高于其他3種菊花，而杭白菊中呈澀味的主要化學成分的含量最低。

表1 5種菊花主要呈澀味化學成分含量?Table 1 The main astringent constituents of the five Chrysanthemum mg/g

2.2 菊花澀味特征分析

2.2.1 味覺特征值 由圖1可知，澀味由強到弱為亳菊>皇菊>貢菊>杭白菊>金絲皇菊。澀味后味由強到弱為皇菊>亳菊>金絲皇菊>貢菊>杭白菊。澀味與澀味后味的強度略有不同，但總體上皇菊和亳菊較澀，且兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。該結(jié)果與成分測定結(jié)果基本一致，說明多酚類化合物是造成菊花茶具有澀味的主要物質(zhì)之一。

小寫字母不同表示同一指標組間差異顯著(P<0.05)圖1 5種菊花的澀味特征值Figure 1 Determination of astringency characteristic values of five species of Chrysanthemum by electronic tongue technique

2.2.2 澀味感官評價 由圖2可知，5種菊花的澀味由強到弱為皇菊>亳菊>金絲皇菊>杭白菊>貢菊。黃酮類、多酚類物質(zhì)呈澀味，因此，菊花茶湯中黃酮類、多酚類物質(zhì)越多，菊花茶的澀味越強。該結(jié)果與電子舌的澀味程度測定結(jié)果有一定差異，但與澀味后味的測定結(jié)果基本一致。研究[15-16]表明，澀感的完全建立通常需要15～20 s，而感官評定的時長遠大于該時間，因此，該結(jié)果綜合了菊花茶湯剛?cè)肟跁r的澀味強度與在評定過程中的澀味強度，且偏向澀味感知最強時的強度。

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)圖2 5種菊花的澀味感官評分Figure 2 Traditional sensory evaluation results of five different varieties of Chrysanthemum

皇菊的澀味明顯強于亳菊，可能是因為感官評定時溫度等條件的不同，電子舌測定時，所有的茶湯都是在室溫條件下測量的，但是傳統(tǒng)感官評定時，隨著試驗的進行，茶湯的溫度逐漸降低，而較高的溫度下，呈澀物質(zhì)與唾液蛋白的結(jié)合更牢固、更持久[17]，有更強的澀感。也可能是因為電子舌技術(shù)是通過檢測不同風味物質(zhì)與人工質(zhì)膜之間的靜電或疏水相互作用引起的膜電位的變化而檢測出不同的味覺強度，而人體是一個復(fù)雜環(huán)境，味覺的產(chǎn)生也受多種因素的影響，且味蕾作為味覺的終端感受器，它們之間存在交叉反應(yīng)性[18]，菊花茶湯中的其他物質(zhì)可能會增強或減弱對澀味的感知。

2.3 唾液與菊花茶湯相互作用

2.3.1 茶湯總蛋白含量 由表2可知，5種菊花茶湯之間的總蛋白含量差異較大，且皇菊>亳菊>金絲皇菊>貢菊>杭白菊。菊花中含有豐富氨基酸[19]，所以菊花茶湯中的總蛋白含量較高。而事實上，菊花茶中某些氨基酸呈澀味，5種菊花中皇菊和亳菊的總蛋白含量較高，這可能也是其澀味較強的原因之一。

表2 5種菊花茶湯總蛋白含量?Table 2 Total protein content of five varieties ofChrysanthemum tea

2.3.2 混合唾液基本指標 由表3可知，與原唾液相比，飲用完皇菊和杭白菊茶湯后的唾液電導(dǎo)率有一定程度的上升，而飲用完其他3種菊花茶湯后的唾液電導(dǎo)率有輕微的下降。飲用完皇菊、杭白菊、亳菊后唾液pH值較原唾液高，而飲用完金絲皇菊和貢菊茶湯后唾液pH值較原唾液低，但是變化的幅度都很小，說明唾液的電導(dǎo)率和pH值對其澀味的影響不大。而飲用完5種不同菊花茶湯后的唾液總蛋白含量差異不大，且都高于原唾液中的總蛋白含量，可能是茶湯中有一部分氨基酸殘留在了口腔中，也有可能因為茶湯中的呈澀物質(zhì)與唾液中的蛋白質(zhì)沉淀后，口腔中的環(huán)境被破壞，為了恢復(fù)口腔環(huán)境，人體會分泌更多的唾液來潤滑口腔，使其回到飲茶前的狀態(tài)，因此飲茶后口腔中的總蛋白含量增加。

表3 飲用5種菊花茶后受試者混合唾液基本指標分析?Table 3 Analysis of basic indices of mixed saliva of subjects after drinking five different varieties of Chrysanthemum tea

2.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳 由于飲用5種菊花茶湯后唾液中的蛋白含量無明顯差異，而5種菊花的澀味有明顯差異性，且皇菊和亳菊的澀味突出，為了進一步研究唾液與菊花茶湯的相互作用，對收集到的唾液進行了SDS-PAGE凝膠電泳試驗。如圖3所示，飲用皇菊茶后收集的唾液所對應(yīng)的條帶(S1)顏色最深，飲用杭白菊茶后收集到的唾液所對應(yīng)的條帶(S3)顏色最淺，且與原唾液所對應(yīng)的條帶(S0)相近，其他的則介于兩者之間。條帶顏色最深說明樣品中蛋白含量最多，因此，結(jié)果表明飲用皇菊茶后收集的唾液樣本中蛋白含量較多，飲用杭白菊茶后收集的唾液中蛋白含量最少，其他3種菊花則介于它們之間。

圖3 飲用5種菊花茶后受試者混合唾液的SDS-PAGE電泳圖Figure 3 SDS-PAGE images of interaction between five different varieties of Chrysanthemum and saliva

2.3.4 唾液淀粉酶沉淀指數(shù) 由圖4可知，5種菊花澀味程度由強到弱為皇菊>亳菊>貢菊>金絲皇菊>杭白菊。該結(jié)果與電子舌和感官評定并不完全一致，可能是因為SAPI值的大小與澀味強弱有一定的相關(guān)性，但是并不完全正相關(guān)，也可能是因為菊花茶的澀味不僅僅完全是呈澀物質(zhì)與唾液蛋白沉淀產(chǎn)生，還存在其他呈澀機制以及受其他因素的影響。

小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)圖4 5種不同菊花的SAPI值Figure 4 SAPI values of five different varieties of Chrysanthemum

3 結(jié)論

多酚和黃酮類化合物的含量與菊花茶湯的澀味強度呈較強的正相關(guān)。5種菊花中多酚和黃酮類化合物含量最多的為皇菊和亳菊，相應(yīng)地澀味最強的兩種菊花也是皇菊和亳菊。菊花茶茶湯中呈澀物質(zhì)與唾液中的蛋白反應(yīng)對唾液的成分及其含量有明顯影響，是引起收斂性、產(chǎn)生澀感的主要原因之一，同時口腔環(huán)境平衡被破壞。由于飲用茶湯后受試者的口腔環(huán)境重新迫切需要回到平衡狀態(tài)，故導(dǎo)致在飲用茶湯后受試者的唾液分泌量和流速均明顯增加。但由于引起澀味感知的物質(zhì)眾多且菊花本身成分復(fù)雜，呈澀物質(zhì)與唾液蛋白沉淀不是產(chǎn)生澀味的唯一機制，還需進行更深入的研究。