鞏曉佩 張 建 郭筱兵 毛曉英 張連富,2

(1. 石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

紅棗(ZiziphusjujubaMill.)又稱大棗、棗子、刺棗，為鼠李科棗屬植物[1]，具有多糖、維生素、黃酮、環(huán)核苷酸、多酚、生物堿等活性物質(zhì)[2-3]。這些生物活性物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抗菌等生物活性[4]。中國(guó)作為世界上棗主產(chǎn)國(guó)，干棗產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的98%[5]。新疆南疆地區(qū)由于早晚溫差大及光照時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)成為中國(guó)紅棗生產(chǎn)最佳地區(qū)。因南疆地區(qū)紅棗加工產(chǎn)業(yè)單一，紅棗產(chǎn)量逐年升高的同時(shí)也產(chǎn)生了大量殘次紅棗，造成紅棗資源的大量浪費(fèi)，殘次紅棗資源的再利用成為人們?nèi)找骊P(guān)注的問(wèn)題。對(duì)紅棗生物活性物質(zhì)進(jìn)行深入研究，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用南疆殘次棗資源。

研究擬以殘次紅棗為研究對(duì)象，純化紅棗多糖(ZJP-1)后進(jìn)行硫酸化修飾后得到紅棗多糖硫酸化衍生物S-ZJP-1，通過(guò)光譜技術(shù)對(duì)其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并通過(guò)體外活性試驗(yàn)探究紅棗多糖的體外抗氧化活性，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用南疆殘次紅棗資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

殘次紅棗：新疆石河子農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

正丁醇、吡啶、三氯甲烷、氯磺酸、剛果紅、DPPH、硫酸亞鐵、甲酰胺、苯酚：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

單糖標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸共8種)：色譜純，上海源葉生物科技有限公司；

抗壞血酸、EDTA-2Na：分析純，上海啟仁化工有限公司。

1.1.2 儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)：HX-10-50B型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：ENK-PRO型，美國(guó)Bioteck公司；

400兆超導(dǎo)核磁共振波譜儀：AVANCE Ⅲ HD型，德國(guó)Bruker公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Nicolet IS 10型，美國(guó)Thermo公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器公司；

掃描電子顯微鏡：S-3400N型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 紅棗多糖的提取純化

(1) 多糖提?。簠⒖糦ang等[12]的方法稍作修改。將干燥的紅棗粉末用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇在70 ℃下回流，持續(xù)4 h，收集殘余物冷凍干燥。將干燥后殘余物用沸水萃取，合并上清液，60 ℃減壓濃縮至原來(lái)的1/4～1/5，脫蛋白(Sevag法)，脫色(AB-8大孔樹(shù)脂)，加無(wú)水乙醇(V無(wú)水乙醇∶V濾液=4∶1)置于冰箱冷藏靜置過(guò)夜，4 000 r/min 離心15 min，收集沉淀物，經(jīng)冷凍干燥24 h后得到紅棗粗多糖(ZJP)。

(2) 分離純化：參考楊燕敏等[13]的方法略作修改。將ZJP在蒸餾水中溶解，離心除沉淀，放入DEAE-52離子交換柱中，用蒸餾水和0.2 mol/L NaCl溶液先后進(jìn)行洗脫。使用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集，用硫酸苯酚法顯色，并在490 nm檢測(cè)吸光度。將紅棗多糖溶液通過(guò)Sephadex-200葡聚糖凝膠柱進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化。冷凍干燥，以獲得純的紅棗多糖(ZJP-1)。

1.2.2 硫酸化紅棗多糖衍生物的制備 參考Zhang等[14]的方法，分別稱取50 mg的ZJP-1、S-ZLP-1，用甲酰胺進(jìn)行溶解，超聲30 min后加入酯化試劑，反應(yīng)結(jié)束后冰水浴冷卻，用4 mol/L的NaOH中和至pH為7。4 ℃下透析3 d。透析結(jié)束后加3倍體積的無(wú)水乙醇，4 ℃靜置12 h，收集沉淀，冷凍干燥24 h后得到硫酸化紅棗多糖(S-ZJP-1)。

1.2.3 多糖理化性質(zhì)的測(cè)定

(1) 硫酸基含量：采用BaCl2—明膠法[15]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.398 8x+0.045 8，R2=0.997 6。

(2) 總糖含量：采用苯酚—硫酸法[16]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.461 5x+0.060 3，R2=0.999 4。

(3) 蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[17]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.069 4x+0.035 9，R2=0.999 1。

(4) 單糖組成：采用離子色譜法[18]。精密稱量10.00 mg 樣品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L 三氟乙酸(TFA)10 mL，120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取5 mL酸水解溶液轉(zhuǎn)移至試管中氮吹吹干，加入5 mL水渦旋混勻。吸取100 μL溶液，加入900 μL去離子水，經(jīng)12 000 r/min離心5 min取上清液分析。色譜柱：DionexCarbopac TMPA20 (3 mm×150 mm)；流動(dòng)相：A為H2O；B為250 mmol/L NaOH；C為50 mmol/L NaOH + 500 mmol/L NaOAc；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)器為電化學(xué)檢測(cè)器。

1.2.4 紅外光譜分析 稱取ZJP-1、S-ZLP-1各1 mg，取20 mg溴化鉀(KBr)混合并研磨均勻后進(jìn)行壓片，掃描波長(zhǎng)范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5 高碘酸氧化分析 參考Xue等[19]的方法略作修改，分別稱取25 mg ZJP-1、S-ZLP-1與15 mL的50 nmol/L NaIO4溶液混合，測(cè)定223 nm處的吸光度值，至終吸光度值不變?yōu)橹?，蒸餾水作為對(duì)照組，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.075 1x+0.087 5，R2=0.997 3，按式(1)計(jì)算高碘酸的消耗量。取2 mL混合溶液，用0.01 mol/L NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑，根據(jù)式(2)計(jì)算甲酸生成量。

A=(50-A1)×15，

(1)

A0=(0.01×Ai)×Aj，

(2)

式中：

A——高碘酸消耗量，mmol；

A1——反應(yīng)后高碘酸濃度，mol/L；

A0——甲酸生成量，mmol；

Ai——NaOH溶液滴定體積，mL；

Aj——反應(yīng)體積，mL。

1.2.6 剛果紅試驗(yàn) 參考徐雅琴等[20]的方法測(cè)定ZJP-1、S-ZLP-1多糖組分是否有三螺旋結(jié)構(gòu)。稱少量的ZJP-1、S-ZLP-1組分配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，取1 mL濃度為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L NaOH溶液分別與1 mL的待測(cè)樣品混合，然后加入2 mL的80 μmol/mL 剛果紅溶液，室溫放置10 min，于200～600 nm 范圍內(nèi)掃描最大吸收波長(zhǎng)并記錄。

1.2.7 掃描電鏡分析 ZJP-1、S-ZLP-1的表面形態(tài)用SEM觀察，放大倍數(shù)為100倍和400倍。

1.2.8 多糖的抗氧化性分析

(1) DPPH自由基清除能力：參考Li等[21]的方法稍作修改，準(zhǔn)備0.1 mmol/L DPPH溶液并在黑暗中貯存。分別準(zhǔn)備0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL ZJP-1和S-ZJP-1溶液。取2 mL多糖溶液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混合靜置30 min，測(cè)量510 nm處吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)式(3)計(jì)算ZJP-1和S-ZJP-1的DPPH自由基清除率。

(3)

式中：

A——DPPH自由基清除率，%；

A0——不加多糖的吸光度；

A1——加入多糖后的吸光度；

A2——不加DPPH溶液的吸光度。

(2) 還原力：參考Ji等[22]的方法，準(zhǔn)備0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)，1%鐵氰化鉀溶液，10%的三氯乙酸溶液和0.1%的三氯化鐵溶液，分別準(zhǔn)備0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL ZJP-1和S-ZJP-1溶液，50 ℃水浴30 min 后加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，以5 000 r/min離心20 min，加入2.5 mL蒸餾水和1.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，靜置10 min后測(cè)量700 nm處吸光度值。以EDTA-2Na為陽(yáng)性對(duì)照，按式(4)計(jì)算ZJP-1和S-ZJP-1的還原能力。

(4)

式中：

A——還原力；

A0——不加樣品的吸光度；

A1——加入樣品后的吸光度；

A2——不加FeCl3溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，采用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化紅棗多糖及硫酸化紅棗多糖的理化指標(biāo)

由表1和表2可知，硫酸化修飾后的紅棗多糖取代度為0.45，與ZJP-1相比，S-ZJP-1的總糖和蛋白質(zhì)含量均下降，其中多糖含量降低可能是硫酸化修飾過(guò)程中酸性條件引起了多糖的降解。兩種紅棗多糖均由3種單糖構(gòu)成，分別是葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖，不同單糖所占摩爾分?jǐn)?shù)不同。說(shuō)明不同的硫酸化修飾并未改變紅棗多糖的單糖組成，硫酸化會(huì)導(dǎo)致硫酸化衍生物的單糖組成的微小變化，不會(huì)改變硫酸化多糖主鏈。伯繼芳等[23]也發(fā)現(xiàn)硫酸化結(jié)構(gòu)修飾不會(huì)破壞杏鮑菇多糖主鏈。

表1 ZJP-1和S-ZJP-1的單糖物質(zhì)的量組成Table 1 The quantitative composition of the monosaccharides of ZJP-1 and S-ZJP-1%

表2 ZJP-1和S-ZJP-1的理化指標(biāo)?Table 2 Physical and chemical indexes of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2 紅棗多糖及其硫酸化多糖的結(jié)構(gòu)表征

圖1 ZJP-1和S-ZJP-1的紅外光譜Figure 1 IR spectrum of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2.2 高碘酸氧化分析 高碘酸氧化是一種選擇性的氧化反應(yīng)，一般作用于多糖分子中二羥基和三羥基連接處?？赏ㄟ^(guò)高碘酸消耗量和甲酸生成量判斷出糖苷鍵的位置[27]。由圖2中NaIO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果得，ZJP-1消耗2.31 mmol的高碘酸并生成0.92 mmol的甲酸，S-ZJP-1消耗2.14 mmol的高碘酸并生成0.81 mmol的甲酸。高碘酸的消耗量大于甲酸生成量的2倍，推測(cè)存在只消耗高碘酸而不產(chǎn)生甲酸的類型，即存在(1→2)和(1→4)連接的糖苷鍵。既消耗高碘酸又生成甲酸說(shuō)明ZJP-1和S-ZJP-1均存在(1→6)連接的糖苷鍵。其中也可能存在不消耗高碘酸且不生成甲酸的類型，存在少量(1→3)連接的糖苷鍵。綜上，通過(guò)高碘酸氧化的反應(yīng)原理初步推斷多糖ZJP-1和S-ZJP-1中均存在(1→2)(1→4)(1→6)和少量(1→3)連接的糖苷鍵。

圖2 ZJP-1和S-ZJP-1的高碘酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 NaIO4 standard curve of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2.3 剛果紅試驗(yàn) 在堿性溶液中，含有三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖會(huì)與剛果紅形成復(fù)合物，其最大吸收波長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生紅移；由此判斷多糖是否具有三股螺旋結(jié)構(gòu)[24]。由圖3可以看出，NaOH溶液濃度從0.0～0.5 mol/L，兩種紅棗多糖ZJP-1和S-ZJP-1與剛果紅反應(yīng)，其最大吸收波長(zhǎng)均隨NaOH溶液濃度的增加而逐漸減小，可以判斷這兩種紅棗多糖不具備三螺旋結(jié)構(gòu)。這與Barbara等[28]研究結(jié)果一致，一般多種單糖組成的多糖不易形成三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖3 ZJP-1和S-ZJP-1的剛果紅試驗(yàn)結(jié)果Figure 3 Experimental results of Congo red of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2.4 掃描電鏡 從圖4可以看出，ZJP-1和S-ZJP-1多糖微觀結(jié)構(gòu)有明顯差異。ZJP-1多為不規(guī)則的大塊片狀結(jié)構(gòu)，而S-ZJP-1為不規(guī)則小塊片狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明硫酸化處理改變了紅棗多糖的結(jié)構(gòu)。Qian等[29]也指出不同種類、提取純化方法和結(jié)構(gòu)改性方法處理后多糖的微觀結(jié)構(gòu)有差異。

圖4 ZJP-1和S-ZJP-1的掃描電鏡圖像Figure 4 Scanning electron microscope images of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.3 多糖抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，兩種紅棗多糖均顯示較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，且兩種紅棗多糖的DPPH自由基清除活性隨紅棗多糖質(zhì)量濃度的增加而升高。當(dāng)質(zhì)量濃度<0.2 mg/mL時(shí)，ZJP-1的DPPH自由基清除活性高于S-ZJP-1。但當(dāng)質(zhì)量濃度>0.2 mg/mL時(shí)，S-ZJP-1較ZJP-1顯示出更強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除活性為47.6%，而ZJP-1為40.4%，說(shuō)明經(jīng)硫酸化修飾改變多糖的理化性質(zhì)和空間構(gòu)象使多糖DPPH自由基清除能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)，較高質(zhì)量濃度的硫酸化修飾的紅棗多糖相比純化紅棗多糖有更高的DPPH自由基清除能力，與宋見(jiàn)喜等[30]結(jié)果一致。

圖5 ZJP-1和S-ZJP-1的DPPH自由基清除作用Figure 5 DPPH clearance of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.3.2 總還原力 由圖6可知，ZJP-1和S-ZJP-1均有一定程度的還原力，并隨著質(zhì)量濃度的增加，兩種紅棗多糖的還原力上升，為濃度依賴型。其中S-ZJP-1較ZJP-1顯示出更強(qiáng)的還原力，當(dāng)S-ZJP-1質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，其還原力最強(qiáng)，為0.531，而此時(shí)ZJP-1的還原力為0.419。經(jīng)過(guò)硫酸化修飾的紅棗多糖相比純化紅棗多糖還原力增高，可能與兩種紅棗多糖的分子量與糖苷鍵有關(guān)。申進(jìn)文等[31]研究也發(fā)現(xiàn)多糖提取物具有較強(qiáng)的體外抗氧化性能，其還原力隨多糖濃度的增大逐漸增強(qiáng)。

圖6 ZJP-1和S-ZJP-1的還原力作用Figure 6 The reducing power effect of ZJP-1 and S-ZJP-1

綜上，S-ZJP-1對(duì)DPPH自由基的清除能力以及還原能力均優(yōu)于ZJP-1。這是因?yàn)槎嗵且肓蛩峄?，改變了多糖的空間構(gòu)象，從而引起了生物活性的改變。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，純化紅棗多糖和硫酸化紅棗多糖均為吡喃型多糖，由半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖3種單糖組成，不含三螺旋結(jié)構(gòu)，均為無(wú)規(guī)則片狀形態(tài)。純化紅棗多糖和硫酸化紅棗多糖均具有較好的抗氧化性，且硫酸化紅棗多糖的抗氧化性強(qiáng)于純化紅棗多糖。綜上所述，硫酸化修飾并未破壞紅棗多糖的主鏈結(jié)構(gòu)，只取代多糖殘基上的某一些羥基，從而改變多糖的分子結(jié)構(gòu)，提高其生物活性，在抗氧化方面具有很好的應(yīng)用前景，尤其在功能性食品、醫(yī)藥領(lǐng)域以及化妝品行業(yè)的廣泛應(yīng)用。關(guān)于硫酸化多糖體外活性與其取代度、分子量等的構(gòu)效關(guān)系以及作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。