童治軍，張軻，孫浩巍，張曉偉，方敦煌，曾建敏，陳學軍，陳丹，龍杰，張冀武，蔡潔云，王春瓊，肖炳光*

生物技術(shù)

鑒別煙草屬植物的特異PCR引物研究

童治軍1，張軻2，孫浩巍2，張曉偉2，方敦煌1，曾建敏1，陳學軍1，陳丹2，龍杰2，張冀武2，蔡潔云2，王春瓊2，肖炳光1*

1云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點實驗室/國家煙草基因工程研究中心，云南昆明 650021；2云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，云南昆明 650106

【】為科學、高效鑒別檢測涉案制煙原料中是否含有煙草材料。利用公共數(shù)據(jù)庫中煙堿代謝途徑相關(guān)基因序列和茄科基因組數(shù)據(jù)（含煙草未公開數(shù)據(jù)）開發(fā)分子標記，通過對3個煙草亞屬11個組的91份煙草材料和17份非煙草材料進行實驗驗證，獲得煙草屬特異性擴增分子標記。從209對新開發(fā)的引物中篩選出2對穩(wěn)定、可靠且具有煙草屬特異性的標記，在91份煙草材料中均有目的擴增片段，而在17份非煙草材料中無擴增產(chǎn)物。上述2對煙草屬特異性標記實現(xiàn)了煙草與非煙草材料的快速、有效鑒別檢測，且方法簡便易行、操作性強，可應用于煙草行業(yè)打假緝私工作中涉案制煙原料的鑒別檢驗。

涉案制煙原料；煙堿；煙草屬特異性標記

隨著我國中式卷煙的發(fā)展，制煙原料的基礎(chǔ)性地位日益凸顯，在巨額利益的驅(qū)使下，大量涉及制煙原料的打假緝私案件（即涉案原料中含有煙草材料）仍層出不窮，給現(xiàn)行的涉案制煙原料[2]鑒別檢驗工作帶來了新的挑戰(zhàn)。

目前，在分子水平上對煙草資源（品種）鑒別檢測的研究報道較多，如利用RFLP[3-5]、RAPD[6-7]、SSR[8-12]、ISSR[13]、DArT[14]、SNP[15-16]等標記對煙草資源（品種）開展遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建。對已知待測樣品屬于煙草材料的鑒別檢測也有少量報道，如利用SSR[17]，SCAR和RAPD標記[18]對初烤煙葉進行品種的快速鑒別。然而在分子水平上對涉案制煙原料的鑒別檢測研究在國內(nèi)外尚無報道。國內(nèi)煙草行業(yè)針對涉案制煙原料的鑒別檢驗工作主要采用感觀檢驗法[19-21]和化學檢驗法[22-24]，但這兩種方法均存在較明顯的缺陷。感觀檢驗法主要依賴檢驗人員對涉案制煙原料的感觀感受和檢驗經(jīng)驗，易受到檢驗人員主觀感受和經(jīng)驗的影響，存在較高比例的誤判性；化學檢驗法通過測定待測樣品是否含有煙堿進而判定樣品是否為煙草專賣品，該方法雖極大地彌補了感觀檢驗法的不足，能對煙堿進行科學而靈敏的定量分析，但因煙堿并非只是煙草獨有，有些茄科植物也能產(chǎn)生煙堿，故此，也存在一定的誤判風險。行業(yè)煙草基因組計劃重大專項的持續(xù)推進及大量煙草品種基因組數(shù)據(jù)的獲得，為利用煙草屬特異的分子標記開展涉案制煙原料鑒定檢驗工作奠定了堅實的理論和技術(shù)基礎(chǔ)?；诖?，本研究利用生物信息學對公共數(shù)據(jù)庫中煙堿代謝途徑的相關(guān)基因序列數(shù)據(jù)、煙草基因組數(shù)據(jù)（包含行業(yè)內(nèi)未公開數(shù)據(jù)）和其它茄科基因組數(shù)據(jù)進行分析并開發(fā)標記，經(jīng)過對91份煙草材料和17份非煙草材料進行實驗驗證，獲得了能鑒別檢測涉案制煙原料中是否含有煙草材料的煙草屬特異性分子標記，旨在為煙草行業(yè)打假緝私工作提供一種快速、高效、簡易的分子水平檢驗技術(shù)，為科學、準確地進行涉案制煙原料鑒別檢驗提供支持。

1　材料與方法

1.1　植物材料

參試的植物材料共計108份，其中，煙草材料91份（見表1），非煙草材料17份（見表2）。91份煙草材料中，屬于3個煙草亞屬11個組的野生煙草材料（種）83份，屬于4種不同類型的栽培煙草材料8份；17份非煙草材料中，十字花科材料1份，豆科材料2份，山茶科材料2份，禾本科材料4份，茄科材料8份。108份材料的選擇是在充分考慮了植物材料中是否含有煙堿、涉案制煙原料中常用的主要植物材料及對已開發(fā)標記的煙草屬特異性實驗驗證等因素下進行的。此外，為了符合涉案制煙原料的烘干狀態(tài)，上述材料分成兩部分進行DNA提取、純化，一部分為不經(jīng)過任何處理的新鮮葉片，另一部分經(jīng)烘箱內(nèi)高溫殺青處理至類似初烤煙葉的烘干狀態(tài)。

表1 91份煙草屬材料詳細信息

續(xù)表1

亞屬 Sub-genus組 Section種 SpeciesPI編號 PI code編號 Accessions 花煙草組Alatae長花煙草 N.longifloraPI 555532M027 長花煙草 N.longifloraPI 555533M028 藍茉莉煙草 N.plumbaginifoliaPI 555548M029 藍茉莉煙草 N.plumbaginifoliaPI 302476M030 藍茉莉煙草 N.plumbaginifoliaPI 302478M031 林煙草 N.sylvestrisPI 555569M032 林煙草 N.sylvestrisPI 555570M033 林煙草 N.sylvestrisPI 555571M034 裸莖煙草組 Nudicaulisae裸莖煙草 N.nudicaulisPI 555540M035 匍匐煙草組Repandae匍匐煙草 N.repandaPI 555552M036 匍匐煙草 N.repandaPI 555551M037 斯托克通氏煙草 N.stocktoniiPI 555538M038 斯托克通氏煙草 N.stocktoniiPI 555539M039 斯托克通氏煙草 N.stocktoniiPI 555560M040 夜花煙草組Noctiflorae夜花煙草 N.noctifloraPI 417918M041 夜花煙草 N.noctifloraPI 475832M042 Petunioides碧冬煙草碧冬煙草 N.petunioidesPI 555547M043 漸尖葉煙草組Acuminatae漸尖葉煙草 N.acuminataPI 555477M044 漸狹葉煙草 N.attenuataPI 555476M045 傘床煙草 N.corymbosaPI 114824M046 少花煙草 N.paucifloraPI 555546M047 印度煙草組Bigelovianae印度煙草 N.bigeloviiPI 555485M048 克里夫蘭氏煙草 N.clavelandiiPI 555491M049 香甜煙草組Suaveolensae非洲煙草 N.africanaPI 555472M050 抱莖煙草 N.amplxicaulisPI 271989M051 抱莖煙草 N.amplxicaulisPI 555682M052 本氏煙草 N.benthamianaPI 555478M053 凱維科拉煙草 N.cavicolaPI 271990M054 迪勃納氏煙草 N. debneyiPI 503320M055 高煙草 N.excelsiorPI 224063M056 高煙草 N.excelsiorPI 555685M057 古特斯皮氏煙草 N.goodspeediiPI 241012M058 哥西氏煙草 N.gosseiPI 230953M059 狹葉煙草 N.linearisPI 555530M060 摩西氏煙草 N.miersiiPI 555537M061 海濱煙草 N.maritimaPI 555535M062 特大管煙草 N.megalosiphonPI 555536M063 特大管煙草 N.megalosiphonPI 555688M064 西方煙草 N.occidentalisPI 271991M065

續(xù)表1

亞屬 Sub-genus組 Section種 SpeciesPI編號 PI code編號 Accessions Petunioides碧冬煙草香甜煙草組Suaveolensae西方煙草 N.occidentalisPI 555687M066 西方煙草 N.occidentalisPI 555541M067 西方煙草 N.occidentalisPI 555690M068 蓮座葉煙草 N.rosulataPI 244635M069 蓮座葉煙草 N.rosulataPI 244624M070 蓮座葉煙草 N.rosulataPI 244628M071 圓葉煙草 N.rotundifoliaPI 555553M072 圓葉煙草 N.rotundifoliaPI 555691M073 香甜煙草 N.suaveolensPI 555500M074 香甜煙草 N.suaveolensPI 555565M075 香甜煙草 N.suaveolensPI 230960M076 簇葉煙草 N.umbraticaPI 271993M077 顫毛煙草 N.velutinaPI 244638M078 顫毛煙草 N.velutinaPI 244630M079 顫毛煙草 N.velutinaPI 244631M080 漸尖葉煙草 N.acuminataPI 555469M081 漸尖葉煙草 N.acuminataPI 42347M082 本氏煙草 N.benthamianaPI 555684M083 名稱 Names類型 Types編號 Accessions K326烤煙 Flue-curedM084 紅花大金元 HD烤煙 Flue-curedM085 TN90白肋煙 BurleyM086 Burley 21白肋煙 BurleyM087 Basma Xanthi香料煙 OrientalM088 Sumsun NN香料煙 OrientalM089 Beinhart1000-1雪茄煙 CigarM090 Florida301雪茄煙 CigarM091

注：83份煙草野生種的編號是以PI編號進行統(tǒng)計的，即存在同名不同PI編號的野生煙草種。

Note: 83 wild tobacco species were numbered with PI accessions, i.e., some wild tobacco species have the same name but different PI accessions.

表2 17份非煙草屬材料信息

續(xù)表2

名稱 Name屬 Genus科 Family編號 Accessions 辣椒 Capsicum annuum L.辣椒屬 Capsicum L.茄科 SolanaceaeM098 茄子 Solanum melongena L.茄屬Solanum L.茄科 SolanaceaeM099 馬鈴薯Solanum tuberosum L.茄屬Solanum L.茄科 SolanaceaeM100 番茄Solanum lycopersicum L.番茄屬 Lycopersicon L.茄科 SolanaceaeM101 矮牽牛/碧冬茄 Petunia hybrida Vil.碧冬茄屬Petunia Juss.茄科 SolanaceaeM102 曼陀羅Datura stramonium L.曼陀羅屬Datura L.茄科 SolanaceaeM103 枸杞Lycium chinense Mill.枸杞屬 Lycium L.茄科 SolanaceaeM104 紫夜香花Cestrum purpureum夜香樹屬 Cestrum L.茄科 SolanaceaeM105 油菜Brassica napus L.蕓薹屬Brassica L.十字花科 BrassicaceaeM106 綠茶Camellia sinensis (L.) O.Kuntze山茶屬Camellia L.山茶科 Theaceae Mirb.M107 普洱茶Camellia sinensis var. assamica山茶屬Camellia L.山茶科 Theaceae Mirb.M108

1.2　基因組數(shù)據(jù)

共計46個與煙堿合成、轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)化及代謝等相關(guān)基因組序列數(shù)據(jù)以FASTA文件格式下載自公共數(shù)據(jù)庫NCBI（National Center for Biotechnology Information；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）[1, 25]，其中，結(jié)構(gòu)基因32個，轉(zhuǎn)錄因子14個，其詳細信息見表3。番茄、馬鈴薯、辣椒、胡椒等基因組數(shù)據(jù)以FASTA文件格式下載自茄科數(shù)據(jù)庫（https://www.sgn.cornell.edu/），已公開的煙草基因組數(shù)據(jù)下載自https://www.sgn.cornell. edu/organism/Nicotiana_tabacum/genome[26]，未公開的煙草全基因組數(shù)據(jù)（紅花大金元、云煙87、Beinhart1000-1、云曬1號及黃花煙G366等）和重測序數(shù)據(jù)（369份煙草核心資源的10-15×基因組重測序數(shù)據(jù)）由本實驗室提供。

表3 煙草煙堿（尼古?。┐x途徑中的部分基因信息

續(xù)表3

名稱Abbr. Name注釋/描述DescriptionNCBI編號NCBI Accession A662LA622L mRNA for isoflavone reductase-like proteinAB445396.1 MPOmethylputrescine oxidaseDQ873385.1 MPO1NtMPO1 mRNA for N-methylputrescine oxidaseAB289456.1 MPO2NtMPO2 mRNA for N-methylputrescine oxidaseAB289457.1 QPTquinolinate phosphoribosyl transferaseAB038494.1 MATEmulti antimicrobial extrusion family proteinAB286961.1 MATE1NtMATE1 gene for multi antimicrobial extrusion family proteinAB286963.1 MATE2NtMATE2 mRNA for multi antimicrobial extrusion family proteinAB286962.1 NUP1nicotine uptake permease 1GU174267.1 NUP2nicotine uptake permease 2GU174268.1 BBLaBBLa mRNA for berberine bridge enzyme-like proteinAB604219.1 BBLbberberine bridge enzyme like protein (T440 gene)AM851017.1 BBLcBBLc mRNA for berberine bridge enzyme-like proteinAB604220.1 BBLdBBLd mRNA for berberine bridge enzyme-like proteinAB604221.1 SPDSspermidine synthaseAF321139.1 AOKR3B.001A05DW001381.1 QSPR48AF154657.1 SAMDCS-adenosylmethionine decarboxylaseU91924.1 JAT1putative MATE transporter (T401 gene)AM991692.1 EFaelongation factor-1 alphaD63396.1 轉(zhuǎn)錄因子 Transcription Factors NtERF189Nicotiana tabacum ERF189 mRNA for ethylene response factor 189AB827951.1 NtERF115Nicotiana tabacum ERF115 mRNA for ethylene response factor 115AB828149.1 NtERF221Nicotiana tabacum ethylene-responsive transcription factor 1-likeXM_016622819.1 NtERF104Nicotiana tabacum ethylene-responsive transcription factor 2-likeXM_016625526.1 NtERF179Nicotiana tabacum ERF179 mRNA for ethylene response factor 179AB828150.1 NtERF17Nicotiana attenuata ethylene-responsive transcription factor 1-likeXM_019377263.1 NtERF168Nicotiana tabacum ERF168 mRNA for ethylene response factor 168AB828151.1 NtMYC2aNicotiana tabacum MYC2a transcription factorHM466974.1 NtMYC2bNicotiana tabacum MYC2b transcription factorHM466975.1 NtMYC2cNicotiana tabacum MYC2c transcription factorHM466976.1 NtERF10Nicotiana tabacum ethylene-responsive transcription factor 2-likeXM_016623277.1 NtERF91Nicotiana tabacum ERF91 mRNA for ethylene response factor 91AB828153.1 NtERF32Nicotiana tomentosiformis ethylene-responsive transcription factor 2XM_009608650.3 ERFSNVNicotiana tomentosiformis AP2-like ethylene-responsive transcription factor AIL5XM_009591706.3

1.3　引物設(shè)計與驗證

利用Primer3（http://www.frodo.wi.mit.edu）軟件對已下載獲得的46個煙堿代謝途徑中的基因序列設(shè)計引物。原則上，針對每個基因的DNA序列設(shè)計3對引物，即在每個基因的起始、結(jié)尾及中間位置截取500 bp的核酸序列進行引物開發(fā)；若基因的DNA序列較大（3 kb以上）時，可適當在基因序列的中部位置增加2～3對引物，最終，針對每個基因設(shè)計出3～6對引物。引物設(shè)計時，相關(guān)參數(shù)的設(shè)定參照童治軍等[27]方法。

利用生物信息學并結(jié)合已公布的煙草（包含行業(yè)內(nèi)尚未公開）基因組數(shù)據(jù)、茄科植物（煙草除外）基因組數(shù)據(jù)及公共數(shù)據(jù)庫（如NCBI、EMBL等）中目前已公開的基因組數(shù)據(jù)，對已開發(fā)獲得的引物進行煙草屬特異性的初步分析。即，將已開發(fā)的全部引物序列比對到上述基因組數(shù)據(jù)中，比對的結(jié)果必須同時滿足：1）引物序列與煙草基因組序列完全比對（Forward & Reverse Ident. %，F(xiàn)orward & Reverse Cvg. %：正反向引物序列100%比對）且比對結(jié)果唯一；2）引物序列與除煙草外其他已知基因組序列不能比對。滿足上述兩個條件的引物為候選煙草屬特異性標記。

利用候選煙草屬特異性標記對參試的108份材料基因組進行PCR擴增，依據(jù)PCR擴增產(chǎn)物結(jié)果進行煙草屬特異性標記實驗驗證。

1.4　PCR擴增及產(chǎn)物檢測

基因DNA提取及純化：分別取上述參試實驗材料的新鮮葉片及高溫殺青處理后葉片100 mg和30 mg置于直徑為8 cm 研缽中，倒入液氮迅速研磨成粉末，然后利用濾柱法（DNeasy Plant Mini Kit (250)試劑盒，QIAGEN公司）提取并純化參試材料的基因組DNA，操作過程及試劑用量均按試劑盒說明書進行。

PCR擴增體系：擴增體系為20 μL，其中包含2.0 μL的10×Buffer（10 mmol/L Tris-HCl，PH 8.4，50 mmol/LKCl，1.5 mmol/L MgCl2），200 μmol/L的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China），0.5 μmol/L的上下游引物（Takara），0.75 U的rTaq聚合酶（Takara），30～50 ng模板DNA，用ddH2O補齊20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min，30個循環(huán)（95℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸5 min，4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物檢測：PCR擴增產(chǎn)物加1/6體積的6×Loading Buffer，取2.5 μL利用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（non-denaturing PAGE，550 V，2.5 h）在DYY-8型電泳儀（北京六一廠）上電泳分離，然后將電泳后的凝膠參照童治軍等[28]的方法進行固定、銀染、漂洗、顯色、漂洗等銀染檢測步驟，最后拍照及膠片數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　煙草屬特異性標記分析

基于46個與煙草煙堿合成、轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)化及代謝等相關(guān)基因的全長DNA序列，共開發(fā)獲得符合設(shè)計要求的引物209對，每個基因開發(fā)獲得3～6對引物，平均4.5（209/46）對。將上述209對引物序列比對至公共數(shù)據(jù)庫中已公開的基因組數(shù)據(jù)（含煙草）及煙草行業(yè)內(nèi)未公開的煙草基因組數(shù)據(jù)，最終獲得5對候選煙草屬特異性引物。由此可知，候選煙草屬特異性引物的獲得率極低，僅有約2.39%。

2.2　煙草屬特異性標記驗證

利用參試的108份材料對5對候選煙草屬特異性引物進行實驗驗證，最終獲得2對引物具有煙草屬特異性（表4）。引物Ntsp027在91份煙草材料中均能擴增出大小為303 bp的特異性條帶（部分煙草材料有大于303 bp的非特異PCR擴增產(chǎn)物），而在17份非煙草材料中均無PCR擴增產(chǎn)物（圖1）。引物Ntsp151在91份煙草材料中均能擴增出大小為300 bp的特異性條帶（部分煙草材料有大于300 bp的非特異PCR擴增產(chǎn)物），而在17份非煙草材料中無PCR擴增產(chǎn)物獲得（圖2）。上述2對引物均能在91份煙草材料中擴增出有效的目標PCR產(chǎn)物條帶，而在17份非煙草材料中無PCR擴增產(chǎn)物檢測出，表明該2對引物具有煙草屬特異性。

表4 煙草屬特異性標記信息

注：編號M001-M091為煙草屬材料，其中M001-M083屬于3個煙草亞屬11個組的野生煙草材料，M084-M091為4種不同類型的栽培煙草材料；編號M092-M108為非煙草屬材料，其中M098-M105是7個屬的茄科材料。最右邊泳道為500 bp DNA marker，從下往上分別為300 bp 和400 bp。

圖2 煙草屬特異標記Ntsp151在108份參試材料中的PCR擴增結(jié)果。最右邊泳道為300 bp DNA marker

3　討論

茄科中的絕大部分植物，尤其是煙草屬植物，均含有一種特殊的生物堿－煙堿，故此，煙堿也就成為茄科植物區(qū)分其他植物的顯著性標志物[29]。為了進一步驗證本文所選擇的46個與煙堿相關(guān)基因的煙草屬特異性，利用生物信息學方法將上述46個基因的DNA序列分別在美國國家生物信息中心庫（NCBI）、歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫（EMBL）、植物基因組與系統(tǒng)生物學庫（PGSB）、茄科基因組數(shù)據(jù)（Sol Genomics Network）及行業(yè)未公開的煙草基因組數(shù)據(jù)進行比對（BLASTn）。當匹配一致性（Ident. %）和覆蓋率（Cvg. %）設(shè)置為≥75%時，BLASTn結(jié)果中除煙草外，也存在其他茄科植物、茶葉甚至少量的微生物；但有9個與煙堿相關(guān)基因的DNA序列（包含NtADC、NtA662和Nt ERF189三個基因）只能在煙草基因組數(shù)據(jù)獲得比對結(jié)果。當進行嚴格的BLASTn（Ident. & Cvg. ≥95%）后，比對結(jié)果中雖仍然含有煙草、其他茄科植物及微生物，但僅在煙草基因組中獲得比對結(jié)果的基因數(shù)量則降低至5個。另一方面，通過利用候選煙草屬特異性標記對108份材料的實驗驗證可知，最終僅有2個基因（1個結(jié)構(gòu)基因，NtADC：arginine decarboxylase和1個轉(zhuǎn)錄因子，Nt ERF189：Nicotiana tabacum ERF189 mRNA for ethylene response factor 189）在匹配一致性和覆蓋率同時滿足≥95%時，具有煙草屬特異性。因此，基于上述2個基因DNA序列開發(fā)的標記具有煙草屬特異性。

本研究開發(fā)的2個煙草屬特異性標記，理論上應符合在煙草屬植物中能擴增出特異的目標PCR產(chǎn)物，而在除煙草外的其他生物（尤其是植物）中無法擴增出特異性目標PCR產(chǎn)物或無法獲得PCR擴增產(chǎn)物。為實現(xiàn)上述2個標記的煙草屬特異性并盡可能的消除假陽性，本研究的核心工作聚焦在大量基因組數(shù)據(jù)的生物信息學分析、實驗材料選擇和煙堿相關(guān)基因的標記開發(fā)上，其中實驗材料的合理選擇是關(guān)鍵：既充分考慮選材的代表性和數(shù)量又兼顧涉案制煙樣品中常用的非煙草材料。具體做法為：首先，利用生物信息學開發(fā)煙堿相關(guān)基因的標記并嚴格比對到大量已公開和未公開的基因組數(shù)據(jù)上，篩選出候選煙草屬特異性標記；其次，選用數(shù)目盡量多且覆蓋度盡可能全的煙草屬材料（3個煙草亞屬11個組的83個野生種和4種類型8個栽培煙草品種）；然后，針對含煙堿的茄科（除煙草屬外）植物，選擇辣椒屬、茄屬、蕃茄屬、碧冬茄屬、曼陀羅屬、枸杞屬和夜香樹屬等7個屬的8種代表性材料；接著，針對不含煙堿的植物材料，選擇日常生活中常見（主栽）且涉案樣品中常用的8屬4科共計9份非煙草材料；最后，利用優(yōu)化后的植物組織基因組提取試劑盒排除微生物DNA，同時，提高PCR擴增時的退火溫度，促進特異性PCR擴增。經(jīng)過上述生物信息學分析、篩選及實驗優(yōu)化、驗證后，獲得了2個標記，可快速、簡易、高效鑒別檢測煙草與非煙草材料，實現(xiàn)了煙草屬特異性標記的開發(fā)。

本研究屬于煙草行業(yè)內(nèi)首次基于分子（DNA）水平鑒別檢測涉案制煙原料的研究，國內(nèi)外雖無相關(guān)報道可供參考與比較，但相較于感觀檢驗法和化學檢驗法具有一定的優(yōu)勢。因該方法中所涉及的標記及PCR擴增產(chǎn)物序列具有煙草屬特異性，且上述DNA序列在生物體內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性和保守性，其可有效避免外部因素（人為、環(huán)境、儀器設(shè)備等）的影響，是一種科學、高效，且簡便易行、可操作性強的煙草與非煙草材料鑒別檢測方法。為了有效彌補行業(yè)內(nèi)打假緝私工作中存在的缺陷，豐富涉案制煙原料的鑒別檢測方法，本文從分子（DNA）水平上開發(fā)煙草屬特異性標記，并用于涉案制煙原料的鑒別檢測，以期進一步提高行業(yè)專賣打假緝私工作的科學性和準確性。

4　結(jié)論

本研究聚焦基因組DNA水平上的涉案制煙原料鑒別檢測，利用生物信息學對公共數(shù)據(jù)庫中煙堿代謝途徑相關(guān)基因序列數(shù)據(jù)和其他生物基因組數(shù)據(jù)進行分析并開發(fā)分子標記，經(jīng)實驗驗證后獲得2對具有煙草屬特異性的分子標記，實現(xiàn)了煙草與非煙草材料的快速、有效鑒別檢測，提高了涉案制煙原料鑒別檢測工作的科學性和準確性，為行業(yè)專賣打假緝私工作提供基因組水平上的分子證據(jù)。

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Study on specific PCR primers for identification ofplants

TONG Zhijun1, ZHANG Ke2, SUN Haowei2, ZHANG Xiaowei2, FANG Dunhuang1, ZENG Jianmin1,CHEN Xuejun1, CHEN Dan2, LONG Jie2, ZHANG Jiwu2, CAI Jieyun2, WANG Chunqiong2, XIAO Bingguang1*

1 Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tobacco Biotechnological Breeding / National Tobacco Genetic Engineering Research Center, Kunming 650021, China;2 Yunnan Tobacco Quality Inspection & Supervision Station, Kunming 650106, China

To scientifically and efficiently identify and detect the tobacco materials contained in the tobacco raw materials involved in the case, molecular markers were developed using the sequence data of genes related to nicotine metabolism pathway and genomic data of Solanaceae (including unpublished tobacco genomic data) in public database in this study. The-specific markers were obtained by experimentally verifying 17 non-tobacco materials and 91 tobacco materials belonging to 11 sections of 3 sub-genus. The results of the study showed that 2 pairs of stable, reliable and-specific primers were screened out from 209 newly developed markers, which could clearly amplify the target length fragments in 91materials, while there was no PCR product amplification in 17 non-materials. The method is simple and easy to operate, so it can be applied to the authenticity determination of tobacco materials in the anti-counterfeiting and anti-smuggling work of tobacco industry.

tobacco raw materials involved; nicotine;-specific markers

. Email：xiaobg@263.net

童治軍，張軻，孫浩巍，等. 鑒別煙草屬植物的特異PCR引物研究[J]. 中國煙草學報，2022，28（2）. TONG Zhijun, ZHANG Ke, SUN Haowei, et al. Study on specific PCR primers for identification of Nicotiana plants[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(2).doi:10.16472/j.chinatobacco.2021.T0024

中國煙草總公司云南省公司項目（2020530000241034）；“煙草抗黑脛病基因聚合與抗黑脛病烤煙新品系選育”（2020530000241009）；“基于拉曼光譜的煙草農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)研發(fā)”（2020530000241037）

童治軍（1980—），博士，副研究員，主要從事煙草分子育種，Tel：0877-2075074，Email：tzj861@163.com

肖炳光（1971—），博士，研究員，主要從事煙草育種研究，Tel：0877-2075076，Email：xiaobg@263.net

2021-02-25；

2021-12-06