劉德水，馮雨晴，李亞飛，史素娟，馬雁軍，周駿，史宏志*

苗期白肋煙和烤煙主要碳水化合物含量差異及形成機理

劉德水1，馮雨晴2，李亞飛2，史素娟1，馬雁軍1，周駿1，史宏志2*

1上海煙草集團有限公司技術(shù)中心北京工作站，北京 101121；2河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州 450002

為探討白肋煙和烤煙煙葉中碳水化合物含量差異，揭示其形成機理。以紅花大金元（HD）、中煙 100（Z100）、TN90、TN86為材料，通過水培試驗，研究烤煙和白肋煙碳水化合物含量、色素含量、光合作用參數(shù)及其碳代謝關(guān)鍵基因表達量差異。白肋煙煙葉中色素、總糖和還原糖含量明顯低于烤煙，在同一施氮水平條件下，白肋煙煙葉還原糖和總糖含量分別較烤煙低42.89%和43.89%；在相近葉片生物量條件下，白肋煙煙葉還原糖和總糖含量分別較烤煙低64.40%和36.46%。白肋煙色素含量和光合作用效率比烤煙低，且碳代謝關(guān)鍵基因和表達水平均低于烤煙，碳固定和同化能力弱，不利于光合作用產(chǎn)物的形成。白肋煙碳水化合物含量與色素含量和光合作用效率呈現(xiàn)出正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達到極顯著水平。色素含量低，光合作用弱，碳固定同化能力弱可能是引起白肋煙主要碳水化合物含量低的關(guān)鍵原因。

烤煙；白肋煙；色素；光合作用；碳同化；碳水化合物

碳水化合物是植物通過光合作用合成的一類重要的有機化合物，是碳代謝過程中的重要產(chǎn)物。煙葉碳水化合物占干物質(zhì)總量的25%～50%，是煙葉所有化合物中含量最多的一類，在煙草生物體中起重要作 用[1]。其中，水溶性總糖和還原糖是最主要的碳水化合物，也是形成香氣物質(zhì)的重要前體物，它們的含量對煙葉質(zhì)量及卷煙品質(zhì)的影響尤為突出[2]。張轉(zhuǎn)勇等[3]研究發(fā)現(xiàn)日照時數(shù)、降雨量、氣溫等生態(tài)因素影響煙葉中總糖和還原糖的含量。王晶等[4]研究發(fā)現(xiàn)，碳代謝旺盛的“豫煙10號”煙葉中總糖和還原糖含量較高。方明等[5]研究表明，磷、鉀營養(yǎng)供應(yīng)不足的煙葉碳代謝過程受到抑制，從而限制光合作用的最初產(chǎn)物－糖的合成。

白肋煙在混合型卷煙葉組配方中的比例高達30%，在調(diào)控煙葉感官質(zhì)量和吸食品質(zhì)中起重要作用[6]。白肋煙主脈乳白色，葉色黃綠，是一種葉綠素缺乏的缺綠突變體[7]。葉綠素是綠色植物吸收光能和光能轉(zhuǎn)化的重要物質(zhì)，其中葉綠素a和葉綠素b直接影響作物的光合同化過程[8]。白肋煙煙葉因缺乏葉綠素，且水溶性總糖和還原糖較低（與烤煙相比），因此探究白肋煙煙葉碳水化合物含量低的原因是提高混合型卷煙質(zhì)量的有效途徑。

目前國內(nèi)外對影響烤煙碳水化合物含量以及提高糖含量的措施進行了廣泛的研究，但對苗期不同類型煙草糖含量形成差異及影響機理研究較少。因此，本研究對烤煙和白肋煙煙葉色素含量、光合作用、最大光量子產(chǎn)量等差異因素進行分析，并結(jié)合關(guān)鍵基因表達量分析，旨在明確造成白肋煙碳水化合物含量低的主要原因，為提升混合型卷煙的質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和培養(yǎng)條件

氣候室條件設(shè)置：溫度22～28℃，濕度75%～80%，實行晝夜交叉光照12 h /12 h（光照時間段為8:00—20:00），光照強度為 400 μmol·m-2·s-1。以烤煙品種紅花大金元（HD）和中煙100（Z100）、白肋煙品種TN90和TN86為試驗材料。用2%的次氯酸鈉溶液消毒種子，連續(xù)消毒兩次，每次消毒5 min，然后播種在育苗盤中。當煙苗長出4～5片真葉（播種40 d后）時，移栽入規(guī)格大小為25 cm×30 cm（直徑×深度）的塑料盆中，用蛭石固定煙苗開展水培試驗。前期研究表明，白肋煙24 mmol/L的供氮條件與烤煙在4 mmol/L時的供氮條件煙葉生物量相近。因此，本研究共設(shè)置6個實驗處理，分別是4 mmol/L供氮條件下的HD、Z100、TN90、TN86和24 mmol/L供氮條件下的TN86和TN90。每個處理進行3次實驗重復，營養(yǎng)液配制采用霍格蘭氏法進行。

1.2 測定項目

選擇長勢均勻一致的煙葉葉片（4 mmol/L和24 mmol/L的供氮條件下培養(yǎng)10 d），每個煙苗選取同一部位的1片煙葉（從上往下數(shù)第4片葉），測定凈光合速率和葉綠素熒光參數(shù)。然后將各處理煙葉平均分成2份，新鮮樣品用于色素含量和轉(zhuǎn)錄組測定，殺青樣品用于煙葉總糖和還原糖測定。

1.2.1 色素含量，光合速率和葉綠素熒光的測定

采用95%乙醇提取測定色素含量[9]。使用便攜式光合作用測定系統(tǒng)（LI-COR Biotechnology，6400XT，Lincoln，NE，USA）測定凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Cd）和胞間二氧化碳濃度（Ci），CO2濃度和光量子通量密度設(shè)定為400 μmol·m-2·s-1和1200 μmol·m-2·s-1。將葉片在黑暗條件下處理20 min，然后用Mini-PAM熒光光度計測定葉綠素a熒光。參考Schreiber的方法測定和計算最大光化學量子產(chǎn)量（Fv/Fm）[10]。

1.2.2 總糖和還原糖含量的測量

取樣品（0.25 g粉末混合物和25 mL，5%乙酸在50 mL錐形瓶中溶解）震蕩30 min后過濾，根據(jù)中國煙草行業(yè)標準YC/T 161，159—2002用流動分析儀測定總糖和還原糖含量[11]。

1.3 碳代謝關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄分析

取液氮保存的材料進行總RNA提取。使用Thermo Fisher Scientific M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板，進行qRT-PCR實驗。、和的引物序列具體如表1，、、、（煙草）的引物序列同之前報道[12]。反應(yīng)擴增程序為：95℃ 10 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。每個處理設(shè)置3次重復。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用 Origin pro 9.0 和Excel 2019進行數(shù)據(jù)分析和圖表制作；使用 SPSS 24.0 軟件進行方差及相關(guān)性分析。將烤煙和白肋煙2個品種的平均值為兩個獨立樣本，用獨立樣本 T 檢驗法對煙株干物質(zhì)積累量、總糖、還原糖、色素、光合速率等指標進行方差齊性檢驗和 T 檢驗，對煙葉干物質(zhì)積累量、總糖和還原糖含量與色素含量和光合速率進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白肋煙和烤煙煙葉還原糖和總糖含量差異

白肋煙和烤煙中還原糖和總糖含量的測定結(jié)果如圖1所示，在同一施氮水平條件下，白肋煙（TN90和TN86）煙葉還原糖和總糖含量的平均值分別較烤煙（HD和Z100）低42.89%和43.89%；在相近葉片生物量條件下，白肋煙（TN90和TN86）煙葉還原糖和總糖含量的平均值分別較烤煙（HD和Z100）低64.40%和36.46%。由此可見，無論是同一施氮水平還是相近生物量條件，白肋煙煙葉碳水化合物的含量明顯低于烤煙。

2.2 白肋煙和烤煙煙葉色素含量差異

白肋煙和烤煙葉片葉綠素含量的測定結(jié)果顯示（圖2），在相同施氮水平下，烤煙兩品種煙葉葉綠素a含量、葉綠素b含量和類胡蘿卜素平均值分別較白肋煙高70.83%、82.76%和50.00%，且差異達極顯著水平（<0.01）。在葉片生物量相近條件下，白肋煙煙葉的類胡蘿卜素含量明顯高于烤煙（類胡蘿卜素含量受施氮量影響較大），而其煙葉葉綠素a和葉綠素b含量與烤煙無顯著差異。由此說明，相同施氮條件下，白肋煙煙葉色素含量顯著低于烤煙，隨著施氮量增加，白肋煙煙葉色素總量、葉綠素a、葉綠素b和胡蘿卜素含量均呈增加趨勢。

注: *1或**1代表在相同的施氮量下，白肋煙兩品種（TN90和TN86）與烤煙品種（HD和Z100）進行比較，差異已達到顯著或極顯著水平（P < 0.05或P < 0.01）。*2或**2代表在相近葉片生物量條件下，白肋煙兩品種（TN90和TN86）與烤煙品種（HD和Z100）進行比較，差異已達到顯著或極顯著水平（P <0.05或P <0.01）。下同。

圖2 白肋煙和烤煙煙葉色素含量差異

2.3 白肋煙和烤煙煙葉最大光量子產(chǎn)量差異

最大光量子產(chǎn)量（Fv/Fm）反映植物潛在最大光合能力，可代表葉綠體中的光系統(tǒng)II（PSⅡ）的最大光化學效率，較高的光化學效率有利于光合色素捕獲光能并以最大的效率轉(zhuǎn)化為化學能，從而獲得更多的能量。白肋煙和烤煙葉片F(xiàn)v/Fm的測定結(jié)果顯示（圖3），在同一施氮水平和相近葉片生物量條件下，白肋煙煙葉最大光量子產(chǎn)量與烤煙煙葉相差不大。由此說明，白肋煙碳水化合物含量與煙葉最大光量子產(chǎn)量無關(guān)。

注: ns代表處理間無顯著性差異。

2.4 白肋煙和烤煙光合參數(shù)差異

白肋煙和烤煙光合參數(shù)的測定結(jié)果如圖4所示，在相同施氮條件下，烤煙兩品種凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Cd）、CO2胞間濃度（Ci）、蒸騰效率（Tr）的平均值分別是白肋煙的1.31倍、3.00倍、2.24倍和3.65倍。葉片生物量積累相近條件下，烤煙煙葉Pn、Ci與白肋煙無顯著差異，但Tr仍顯著高于白肋煙，其平均值為白肋煙的1.70倍。由此可見，白肋煙和烤煙之間光合速率存在明顯差異，且差異達到顯著或極顯著性水平。

2.5 相關(guān)性分析

在相同施氮條件下，白肋煙和烤煙煙葉總糖和還原糖含量與葉綠素a含量、色素含量和凈光合速率呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)達到極顯著水平。由此可知，煙葉中碳水化合物含量與色素含量和光合作用關(guān)系密切，提高白肋煙中色素含量和光合速率有助于提高煙葉中碳水化合物含量。

圖4 白肋煙和烤煙光合參數(shù)差異

表2 碳水化合物含量與色素含量、葉綠素a和凈光合速率的相關(guān)性分析

2.6 白肋煙和烤煙煙葉碳代謝差異基因分析

白肋煙和烤煙碳代謝關(guān)鍵基因表達量的分析結(jié)果顯示（圖5），在同一施氮量和相近葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉中光合碳固定和糖類物質(zhì)合成相關(guān)基因（）表達水平均比烤煙低。其中，相同施氮量，烤煙和基因表達量分別是白肋煙的6.22倍、4.47倍，葉片生物量相近條件下，烤煙和基因表達量分別是白肋煙的3.76倍和3.66倍。由此說明，白肋煙煙葉光合碳固定能力弱，蔗糖和淀粉合成能力低，從而導致白肋煙煙葉糖含量低。

注：（a），基因EGY1 (Gene Probable zinc metalloprotease)；（b），基因CP12-2 (Gene Calvin cycle protein)；（c），基因SUS2（Gene Sucrose synthase）；（d），基因gpmA（Gene 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase）；（e），基因AGPS1（Gene Glucose-1-phosphate adenylyltransferase large subunit 1）；（f），基因GDHA（Gene Glutamate dehydrogenase A）。

3 討論

不同煙草品種煙葉碳水化合物含量差異顯著，其中白肋煙煙葉中總糖和還原糖含量與烤煙有較大差異[5]。本研究結(jié)果顯示，在相同施氮量和相近生物量條件下，白肋煙兩品種中煙葉總糖和還原糖含量明顯低于烤煙品種，且受碳固定同化過程的關(guān)鍵因子影響。

光合作用是綠色植物重要的生化反應(yīng)過程，其中，PSII作為光合作用的主要場所，可以直接捕獲光能并完成水的光解和質(zhì)體醌的還原，對于光合作用的開啟具有重要作用[13]。編碼一個定位于類囊體膜上的金屬蛋白酶，突變體表現(xiàn)為葉色黃綠，葉綠體和光合系統(tǒng)II穩(wěn)定性下降，葉綠素含量降低，從而影響植物生長[14-15]。編碼葉綠體基質(zhì)中的一種小肽，且CP12蛋白可與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和磷酸核酮糖激酶（PRK）（卡爾文循環(huán)的兩種關(guān)鍵酶）形成一種超分子復合物，從而調(diào)節(jié)光合作用[16]。研究表明，的轉(zhuǎn)錄物在決定葉片光合作用能力方面起重要作用[17]。Marri等也發(fā)現(xiàn)，CP12蛋白氧化對植物不同環(huán)境條件下光合過程的整體平衡至關(guān)重要[18]。葉綠素含量降低在一定程度上能抑制葉綠體發(fā)育，降低光合速率，影響植物體的有機物質(zhì)積累、生長發(fā)育和產(chǎn)量形成[19]。拓陽陽等[20]研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素a與總糖含量呈顯著正相關(guān)。本研究表明，在相同施氮水平下，白肋煙煙葉色素總含量明顯低于烤煙，且差異達極顯著水平，與其光合速率低于烤煙的表現(xiàn)一致?；虮磉_量結(jié)果表明，同一施氮量和相同生物量條件下，白肋煙和基因表達量顯著低于烤煙，導致其色素含量和光合作用效率低，進一步影響白肋煙煙葉中總糖和還原糖含量。

蔗糖與淀粉代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達，與煙葉中糖類物質(zhì)的含量密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白肋煙煙葉蔗糖和淀粉代謝途徑關(guān)鍵基因表達量低于烤煙，可能是其糖含量低的重要原因。蔗糖合成酶（SUS）是植物中廣泛存在的一種UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，也是催化蔗糖代謝的關(guān)鍵酶，在種子和果實的發(fā)育中發(fā)揮作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，過量表達基因的轉(zhuǎn)基因煙草中可溶性總糖含量顯著高于野生植株[22]。由基因編碼的磷酸甘油酸變位酶是糖異生和糖酵解過程中的重要產(chǎn)物，在光合碳固定過程發(fā)揮重要作用[23]。焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉合成過程中的限速酶，趙凱琴等[24]研究表明過表達外源AGPase基因，可增加油菜胚淀粉的合成。本試驗中，相同施氮量和相同生物量條件下，白肋煙可溶性總糖和還原糖含量顯著低于烤煙，與蔗糖和淀粉合成途徑中關(guān)鍵基因和表達量低密切相關(guān)。

谷氨酸脫氫酶（GDH）是煙葉氮代謝的關(guān)鍵酶，通過提高氮同化能力來增加酶及葉綠素的積累量，從而間接影響植物的碳同化。氮同化過程利用碳代謝合成的碳架合成蛋白質(zhì)和氨基酸，GDH可在碳架不足時通過脫氨作用提供碳骨架[25-26]。申麗霞等[27]研究認為較高的GDH活性有利于催化和加速合成谷氨酸，維持葉片較強的碳代謝。Egami等[28]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的葉片在開花期的可溶性蛋白質(zhì)濃度和光合作用效率均增加。本研究中，相同施氮量和相近生物量下白肋煙煙葉總糖和還原糖含量和基因表達量均低于烤煙，推測白肋煙煙葉糖含量低以及氮同化過程中碳架不足是導致煙葉硝酸鹽含量和氮素利用效率低于烤煙的原因，這對提高煙葉安全性和減肥增效不利，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

在相同施氮水平和相近葉片生物量積累條件下，白肋煙煙葉中還原糖和總糖含量明顯低于烤煙，并且色素含量、光合作用均低于烤煙。白肋煙碳固定和糖類物質(zhì)合成相關(guān)基因（、、、、、）表達量顯著降低；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，總糖和還原糖含量與色素含量和凈光合速率呈顯著正相關(guān)。色素含量低，光合作用弱，碳固定同化能力弱可能是引起白肋煙碳水化合物含量低的關(guān)鍵原因。

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Difference in carbohydrate content between burley tobacco and flue-cured tobacco and the related formation mechanism

LIU Deshui1, FENG Yuqing2, LI Yafei2, SHI Sujuan1, MA Yanjun1, ZHOU Jun1, SHI Hongzhi2*

1 Technology Center, Shanghai Tobacco Group Beijing Cigarette Factory Co., Ltd., Beijing 101121, China;2 College of Tobacco,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China

To investigate the difference in carbohydrate content between burley tobacco and flue-cured tobacco leaves, pots experiments were carried out to reveal the formation mechanism within.By using flue-cured tobacco (HD, Z100) and burley tobacco (TN90, TN86) as research objects, the hydroponic experiments were conducted to study differences in pigments, photosynthesis, carbohydrates and transcriptome.The results showed that the contents of pigment, reducing sugar and total sugar in flue-cured tobacco was significantly higher than that in burley tobacco. Under same nitrogen level, the content of reducing sugar and total sugar of burley tobacco were lower than that of flue-cured tobacco by 42.89% and 43.89% respectively. Under the same leaf biomass, the contents of reducing sugar and total sugar of the burley tobacco were 36.46% and 64.40% lower than that of flue-cured tobacco, respectively. Moreover, compared with flue-cured tobacco, burley tobacco had lower pigment content and photosynthetic efficiency, and weaker carbon fixation and assimilation ability. Also, genes () expression level were all significantly lower in burley tobacco than in flue-cured tobacco. Besides, correlation coefficient between total sugar content, reducing sugar content and pigment content, photosynthesis were significantly positive.Low pigment content, weak photosynthesis, weak carbon fixation assimilation ability were the key reasons for low content of carbohydrate in burley tobacco.

burley tobacco; flue-cured tobacco; pigment; photosythesis; carbon assimilation; carbohydrate

. Email：shihongzhi88@163.com

劉德水，馮雨晴，李亞飛，等. 苗期白肋煙和烤煙主要碳水化合物含量差異及形成機理[J]. 中國煙草學報，2022，28（2）.LIU Deshui, FENG Yuqing, LI Yafei, et al. Difference in carbohydrate content between burley tobacco and flue-cured tobacco and the related formation mechanism [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(2).doi:10.16472/j.chinatobacco.2021.158

上海煙草集團北京卷煙廠有限公司科技項目“煙草硝酸鹽積累機理及降低硝酸鹽含量調(diào)節(jié)技術(shù)研究”（TP2019-C4）

劉德水（1988—），博士研究生，Email：deshui@yeah.net

史宏志（1963—），博士，教授，主要從事煙草栽培生理研究，Email：shihongzhi88@163.com

2021-08-17；

2021-12-17