王在旗 紀(jì)金龍 沈在欽 謝學(xué)江

（作者單位：廈門(mén)市計(jì)量檢定測(cè)試院）

引言

自2020 年暴發(fā)全球性新冠肺炎疫情以來(lái)，針對(duì)新型冠狀病毒的核酸檢測(cè)方法和設(shè)備——聚合酶鏈反應(yīng)分析儀（也稱(chēng)基因擴(kuò)增儀，以下簡(jiǎn)稱(chēng)PCR儀）的研究受到了極大的重視，發(fā)展迅速。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)PCR 技術(shù)）出現(xiàn)于20 世紀(jì)80 年代，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的應(yīng)用、優(yōu)化和發(fā)展，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。其主要是對(duì)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)溫度進(jìn)行快速改變和精確控制，通過(guò)重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸實(shí)現(xiàn)DNA 序列的體外擴(kuò)增，從而為進(jìn)一步的基因檢測(cè)提供足夠多的DNA 片段。

PCR 儀最主要的計(jì)量參數(shù)是溫度，溫度的準(zhǔn)確性、均勻性，升溫速率和降溫速率等技術(shù)指標(biāo)的優(yōu)劣直接影響了DNA 序列的擴(kuò)增效果。如果溫度出現(xiàn)較大的非期望偏離，獲得的DNA 片段數(shù)量無(wú)法滿(mǎn)足后續(xù)核酸測(cè)序的需要，可能直接導(dǎo)致“漏檢”現(xiàn)象，埋下疫情擴(kuò)散的隱患。目前，各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)，特別是城市核酸檢測(cè)基地都配置了大量的PCR儀，對(duì)其性能的要求也越來(lái)越高，這意味著對(duì)PCR儀溫度校準(zhǔn)裝置的要求也不斷提高。為確保PCR儀溫度的準(zhǔn)確可靠，本文擬從PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置的溯源方法研究著手，提升PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置測(cè)量結(jié)果的置信水平，保證其對(duì)PCR 儀溯源結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

PCR 儀及其溫度校準(zhǔn)裝置概述

PCR 儀市場(chǎng)巨大，國(guó)內(nèi)外品牌及設(shè)備類(lèi)型眾多，但是其加熱模塊基本上都是扁平板狀多孔設(shè)計(jì)，有24 孔、48 孔、96 孔、384 孔等，其中又以96 孔的PCR 儀最為常見(jiàn)。圖1 是一款比較常見(jiàn)的96孔PCR 儀。

1.PCR 儀的作用及原理

當(dāng)采集到的樣品中DNA 含量太低，無(wú)法滿(mǎn)足正常儀器進(jìn)行檢測(cè)分析的量，就需要將樣品溶解在特定溶劑中，通過(guò)PCR 儀來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品中DNA 的擴(kuò)增，擴(kuò)增的倍數(shù)為2 的N 次方。其工作原理是：雙鏈DNA 在一定的環(huán)境中，通過(guò)在90～95℃變性，形成單鏈，然后退火降溫到40～60℃，在引物及其他輔助因子的作用下，使其初步結(jié)合，再快速升溫至70～75℃，在相關(guān)酶的催化作用下，合成雙鏈，完成一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。通過(guò)PCR 儀對(duì)溫度的精確控制和快速循環(huán)，達(dá)到短時(shí)間內(nèi)高效擴(kuò)增的效果。

2.PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置

PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置是用于校準(zhǔn)PCR 儀溫度參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)裝置，JJF1821—2020 《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀溫度校準(zhǔn)裝置校準(zhǔn)規(guī)范》明確提出校準(zhǔn)裝置組成應(yīng)包含通常為15 個(gè)的數(shù)據(jù)采集分析模塊、精密溫度傳感器，測(cè)溫范圍介于0～120℃之間，測(cè)量不確定度不超過(guò)0.1℃，且要求定期進(jìn)行計(jì)量檢定。圖2 是一款常見(jiàn)的PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置，其核心部件是作為傳感器的測(cè)溫模塊，一般采用高精度熱敏電阻探頭，并結(jié)合PCR 儀測(cè)試孔的形狀，封裝成扁平類(lèi)采集器，使其與PCR儀完美貼合，確保測(cè)溫結(jié)果更加真實(shí)準(zhǔn)確。

PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置的溯源方法研究

2020 年國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布了JJF1821—2020《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀溫度校準(zhǔn)裝置校準(zhǔn)規(guī)范》，為PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置的溯源提供了方法依據(jù)以及標(biāo)準(zhǔn)裝置的性能指標(biāo)要求。采用二等及以上等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)鉑電阻溫度計(jì)與0.005級(jí)的電測(cè)設(shè)備連接構(gòu)成高精度測(cè)溫系統(tǒng)對(duì)校準(zhǔn)裝置性能進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)要求作為提供恒定溫場(chǎng)的主要配套設(shè)備——恒溫槽及均溫塊也提出了一定的要求，見(jiàn)下表，均溫塊見(jiàn)圖3。

主要配套設(shè)備的性能指標(biāo)表

規(guī)程JJF1821—2020 采用的校準(zhǔn)方案是將PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置的測(cè)溫模塊封裝在均溫塊內(nèi)部，并整體浸入恒溫槽中，溫度穩(wěn)定之后讀取測(cè)量值。但是這種方法存在兩個(gè)方面的主要問(wèn)題：一是對(duì)均溫塊的要求較高，需要絕對(duì)密封且無(wú)空氣存在，并且測(cè)溫模塊的傳感器頭要求與均溫塊緊密貼合。其次均溫塊大部分采用不銹鋼材料制成，即使大部分浸入恒溫槽中，仍會(huì)存在較大的軸向?qū)?，直接影響測(cè)試孔的溫度。二是這種溯源方案只能對(duì)PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置進(jìn)行定值溯源，無(wú)法對(duì)測(cè)溫模塊傳感器的響應(yīng)情況進(jìn)行校準(zhǔn)，無(wú)法滿(mǎn)足PCR 儀升降溫速率測(cè)量的溯源要求。因此本文提出了一種采用一體化快速熱循環(huán)溫變系統(tǒng)對(duì)測(cè)溫模塊傳感器進(jìn)行直接測(cè)溫的溯源方法，模擬實(shí)際PCR 儀工作過(guò)程，避免了由均溫塊引入的一系列測(cè)量不確定因素，提升了操作便利性以及測(cè)量精度，滿(mǎn)足溯源要求。設(shè)計(jì)流程圖見(jiàn)圖4。

首先，測(cè)溫模塊通過(guò)模擬PCR 儀的加熱板設(shè)計(jì)，測(cè)試孔的位置形狀能夠與PCR 儀測(cè)溫模板的傳感器頭完全貼合。整體采用紫銅材料，孔腔鍍金，提高抗氧化性。測(cè)溫板內(nèi)部為空腔，高導(dǎo)熱液在空腔中快速流動(dòng)，其中測(cè)溫孔腔與導(dǎo)熱液體充分接觸，能夠?qū)崿F(xiàn)快速換熱和平衡。其次，熱液系統(tǒng)和冷液系統(tǒng)通過(guò)流量控制系統(tǒng)將導(dǎo)熱液進(jìn)行混合后快速泵入測(cè)溫模塊的空腔內(nèi)，溫度測(cè)控系統(tǒng)測(cè)量測(cè)溫模塊空腔內(nèi)的液體溫度并反饋給熱液系統(tǒng)和冷液系統(tǒng)的相關(guān)控制模塊和流量控制系統(tǒng)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)混合導(dǎo)熱液體的溫度，達(dá)到快速升降溫的目的。最后，回液系統(tǒng)再將導(dǎo)熱液分流至冷熱液系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高效循環(huán)。

總結(jié)

PCR 儀通過(guò)對(duì)基因的快速擴(kuò)增，滿(mǎn)足了目前新冠病毒核酸檢測(cè)樣本數(shù)量的需要，是核酸檢測(cè)最主要的設(shè)備之一。確保PCR 儀參數(shù)準(zhǔn)確、性能可靠，需要按照國(guó)家的規(guī)程規(guī)范，利用PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置進(jìn)行計(jì)量。而PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置作為標(biāo)準(zhǔn)裝置，其計(jì)量性能確認(rèn)無(wú)疑是更加重要。本文通過(guò)分析目前常規(guī)溯源方法，發(fā)現(xiàn)采用均溫塊的方案存在諸多容易引入誤差的不確定因素，因此進(jìn)一步提出采用導(dǎo)熱液快速循環(huán)換熱系統(tǒng)對(duì)測(cè)溫模塊的傳感器進(jìn)行直接溯源的方法，這對(duì)于PCR 儀溫度校準(zhǔn)裝置的溯源方法和標(biāo)準(zhǔn)裝置的改進(jìn)具有一定的參考價(jià)值。