季曉君，苗雷，馬昌友，唐瑩，周秋華，吳艦，徐丹

0 引言

近年來(lái)隨著基因組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，我們可以全面描述患者和健康者基因組之間的差異。腫瘤的主要特征之一是基因突變引起的細(xì)胞生長(zhǎng)異常和失控，這些突變被稱為“驅(qū)動(dòng)器”。腫瘤研究的主要目標(biāo)之一就是發(fā)現(xiàn)不同腫瘤中的驅(qū)動(dòng)基因，為開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤靶向治療藥物以及尋找治療反應(yīng)或預(yù)后的生物標(biāo)志物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。已有多項(xiàng)權(quán)威文獻(xiàn)對(duì)腫瘤的驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行了系統(tǒng)性分析[1-2]。為了能夠鑒定盡可能多的驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生的突變基因，西班牙巴塞羅那生物醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家們對(duì)66個(gè)癌種，221個(gè)隊(duì)列的28 076個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行了突變基因的生物信息學(xué)分析，形成了龐大的Integrative Onco Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.intogen.org/search），以幫助研究者更好地獲取這些突變基因的相關(guān)信息[3]。

2020年美國(guó)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌及胰腺癌是發(fā)病率及死亡率均排名前五的消化系統(tǒng)腫瘤。預(yù)計(jì)的新發(fā)患者人數(shù)占所有消化系統(tǒng)腫瘤新發(fā)人數(shù)的88.2%，死亡人數(shù)占所有消化系統(tǒng)腫瘤死亡人數(shù)的93.9%[4]。然而，針對(duì)晚期無(wú)法手術(shù)的消化系統(tǒng)腫瘤，至今仍然缺乏有效的治療藥物。根據(jù)2020年CSCO臨床診療指南推薦，食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌以及胰腺癌的藥物治療仍然是以氟尿嘧啶、鉑類、紫杉類等化療藥物為主。鑒于消化系統(tǒng)腫瘤治療藥物未滿足臨床需求的現(xiàn)狀，本文搜集Integrative Onco Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)中上述5種消化系統(tǒng)腫瘤的突變基因，對(duì)各腫瘤中突變基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，以突變基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，結(jié)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)突變基因及其編碼的蛋白質(zhì)作為新藥開(kāi)發(fā)靶點(diǎn)的可行性進(jìn)行評(píng)估，為常見(jiàn)消化系統(tǒng)腫瘤的治療藥物開(kāi)發(fā)提供新的生物信息學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

檢索Integrative Onco Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)建庫(kù)至2021年6月7日有關(guān)食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌及胰腺癌的突變基因數(shù)據(jù)。食管癌共7個(gè)隊(duì)列，945個(gè)樣本。胃癌共5個(gè)隊(duì)列，707個(gè)樣本。結(jié)直腸癌共7個(gè)隊(duì)列，1281個(gè)樣本。肝癌共9個(gè)隊(duì)列，1 616個(gè)樣本。胰腺癌共7個(gè)隊(duì)列，896個(gè)樣本，見(jiàn)表1。

表1 5種消化系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤的隊(duì)列數(shù)、樣本數(shù)及突變基因數(shù)Table 1 Number of cohorts,samples and mutant genes of five common tumors of digestive system

1.2 分析方法

1.2.1 Venn分析 利用在線Venn分析工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），對(duì)5個(gè)癌種中排名前10的突變基因進(jìn)行Venn分析。

1.2.2 以突變基因?yàn)榘悬c(diǎn)的新藥研究現(xiàn)狀分析 利用Cortellis數(shù)據(jù)庫(kù)（https://access.cortellis.cn/login?app=cortellis）對(duì)需要分析的基因進(jìn)行檢索，檢索范圍為建庫(kù)至2021年6月17日的數(shù)據(jù)，檢索關(guān)鍵詞為基因?qū)?yīng)的蛋白簡(jiǎn)稱或全稱。對(duì)分類項(xiàng)為“Drugs”中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，剔除其中“Highest Status”為“Discontinued”以及“No Development Reported”的數(shù)據(jù)，對(duì)剩余數(shù)據(jù)的“Highest Status”以及“Technologies”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)?！癏ighest Status”中研究狀態(tài)為“Pre-clinical”以及“Discovery”統(tǒng)一為臨床前研究，“Technologies”中的抗體藥物、融合蛋白、細(xì)胞治療等非傳統(tǒng)小分子治療方式統(tǒng)一為生物治療。

1.2.3 靶點(diǎn)成藥性分析 利用英國(guó)癌癥研究所開(kāi)發(fā)的canSAR數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cansarblack.icr.ac.uk/）對(duì)基因編碼的蛋白進(jìn)行靶點(diǎn)成藥性分析。利用數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白注釋工具，對(duì)蛋白的亞細(xì)胞分布、可成藥3D結(jié)構(gòu)數(shù)目、活性小分子數(shù)量進(jìn)行批量分析。同時(shí)，對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行檢索，統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的癌癥相關(guān)指數(shù)、可與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域數(shù)量、基于化學(xué)的評(píng)分以及抗體藥物成藥性。本研究為評(píng)估蛋白的抗癌藥物靶點(diǎn)成藥潛力，設(shè)置了以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）癌癥相關(guān)評(píng)分＞70；（2）可成藥3D結(jié)構(gòu)數(shù)目≥1；（3）可與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域數(shù)量或活性小分子數(shù)量≥1；（4）基于化學(xué)的評(píng)分＞70；（5）抗體成藥性為Y。若被評(píng)估蛋白同時(shí)滿足（1）、（2）～（4）中的任意二項(xiàng)或（5）即被認(rèn)為具有較大的成藥潛力。

2 結(jié)果

2.1 消化系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤突變基因分析

對(duì)上述5種腫瘤的突變基因進(jìn)行分析，按照突變基因占所有樣本的百分比進(jìn)行排序，每種腫瘤選擇排名前10的突變基因進(jìn)行Venn分析。結(jié)果顯示，TP53在5種腫瘤中均為常見(jiàn)的突變基因，ARID1A及SMAD的突變?cè)?種腫瘤中有重疊，KMT2D、KRAS及PIK3CA的突變?cè)?種腫瘤中有重疊，APC、FAT4、CDKN2A及LRP1B的突變?cè)?種腫瘤中有重疊，見(jiàn)圖1A。為研究原位與轉(zhuǎn)移性腫瘤中突變基因的差別，分別統(tǒng)計(jì)了5種腫瘤中原位及轉(zhuǎn)移性腫瘤中排名前10的突變基因。結(jié)果顯示，APC、FAM135B以及NIPBL的基因突變?cè)谵D(zhuǎn)移性食管癌中更為常見(jiàn)，見(jiàn)圖1B。在胃癌以及肝癌中，原位與轉(zhuǎn)移性腫瘤中常見(jiàn)的基因突變差異較大，僅有TP53、SMAD4、KRAS三個(gè)基因（胃癌）及TP53、CTNNB1、ARID1A、ARID2四個(gè)基因（肝癌）的突變?cè)谠患稗D(zhuǎn)移性腫瘤中重疊，見(jiàn)圖1C、1E。與胃癌及肝癌相反，結(jié)直腸癌及胰腺癌中兩種亞型的常見(jiàn)基因突變較為相似，大部分基因的突變?cè)谠患稗D(zhuǎn)移性腫瘤中保持一致，見(jiàn)圖1D、1F。

通過(guò)對(duì)原位及轉(zhuǎn)移性腫瘤中所有檢測(cè)到的突變基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，有部分突變的基因僅在轉(zhuǎn)移性腫瘤中被檢測(cè)到，如食管癌中的FAM135B、NIPBL、NTRK3及TLL1；胃癌中的FAT4、MYH9及FAT3；結(jié)直腸癌中的HSPG2、BRCA2及PTPRC；肝癌中的MAP3K1、KMT2C、ZNF521及ABL1；胰腺癌中的CDH10及BAP1，見(jiàn)圖2。

2.2 以突變基因編碼的蛋白為靶點(diǎn)的新藥研究現(xiàn)狀

以上在各腫瘤中突變頻率較高的基因及僅在轉(zhuǎn)移性腫瘤中檢測(cè)到的突變基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它們自身及其編碼的蛋白都有可能作為抗腫瘤新藥開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)。本研究中，我們重點(diǎn)關(guān)注這些突變基因編碼的蛋白。通過(guò)對(duì)上述62個(gè)突變基因（5種腫瘤中突變發(fā)生率排名前10的基因）編碼的蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索及分析，共篩選到了22個(gè)突變基因編碼的蛋白，見(jiàn)表2。截至我們檢索數(shù)據(jù)的日期，至少有一項(xiàng)以這些蛋白為靶點(diǎn)的新藥研究正在開(kāi)展。僅在轉(zhuǎn)移性腫瘤中檢測(cè)到的35個(gè)突變基因中，有10個(gè)突變基因編碼的蛋白正在作為抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)進(jìn)行開(kāi)發(fā)，見(jiàn)表2。在靶向藥物的類型中，依然是小分子占多數(shù)，然而在一些研究較為成熟的靶點(diǎn)（如TP53、KRAS、EGFR、KIT及ERBB3等），生物治療的數(shù)量正在迅速攀升，生物藥的開(kāi)發(fā)已然成為抗腫瘤新藥開(kāi)發(fā)中不可或缺的一部分。

表2 以22個(gè)突變基因編碼的蛋白為靶點(diǎn)的新藥研究概況Table 2 Overview of new drug research targeting proteins encoded by 22 mutant genes

2.3 新靶點(diǎn)的成藥性評(píng)估

在62個(gè)突變基因編碼的蛋白中，前面已篩選了22個(gè)作為新藥靶點(diǎn)進(jìn)行開(kāi)發(fā)的蛋白，因此我們利用canSAR數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)剩余的40個(gè)蛋白進(jìn)行抗癌藥物靶點(diǎn)成藥性分析，結(jié)果顯示：篩選出17個(gè)基因編碼的蛋白具備作為抗癌藥物開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)，分別為HRAS、TGFBR2、RPS6KA3、SMAD4、BMPR1A、NF1、IL6ST、KMT2C、EIF3E、NSD1、MYH9、HSPG2、KMT2D、MAP3K1、GNAS、RNF43及TSC2。其中，HRAS、BMPR1A、NF1、EIF3E以及HSPG2基因的突變僅在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中被檢測(cè)到；IL6ST、KMT2C、MAP3K1基因的突變僅在轉(zhuǎn)移性肝癌中被檢測(cè)到；NSD1基因的突變僅在轉(zhuǎn)移性胃癌中被檢測(cè)到。在篩選到的17個(gè)基因編碼的蛋白中，有12個(gè)蛋白僅可作為小分子抗癌藥物的潛在靶點(diǎn)，有5個(gè)蛋白由于在細(xì)胞膜上有分布，因此可同時(shí)作為小分子及大分子抗癌藥物的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)表3。

表3 40個(gè)突變基因編碼蛋白的成藥性分析Table 3 Druggability assessment of proteins encoded by 40 mutant genes

為了進(jìn)一步分析以上17個(gè)蛋白的突變或表達(dá)水平與消化道腫瘤的相關(guān)性，利用canSAR數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)17個(gè)蛋白與31個(gè)腫瘤的相關(guān)性評(píng)分進(jìn)行排名（突變及表達(dá)水平），除了GNAS基因編碼的蛋白未檢索到相關(guān)腫瘤類型，其余16個(gè)基因檢索到的評(píng)分排名見(jiàn)表4。除HRAS以及RPS6KA3外，其余基因的突變都與胃癌的發(fā)生有明顯的相關(guān)性（排名前10位，下同），相反，這些基因編碼的蛋白表達(dá)與胃癌的發(fā)生并沒(méi)有顯示出明顯的相關(guān)性。因此，如選擇這些蛋白作為胃癌治療的靶點(diǎn)時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這些蛋白編碼基因的突變。在結(jié)直腸癌中，9個(gè)基因的突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生有明顯相關(guān)性，14個(gè)蛋白的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)。在肝癌中，5個(gè)基因（RPS6KA3、BMPR1A、IL6ST、KMT2D以及TSC2）的突變及3個(gè)基因編碼的蛋白（SMAD4、BMPR1A、MYH9）表達(dá)與肝癌的發(fā)生明顯相關(guān)。在16個(gè)基因中，僅TGFBR2、SMAD4以及BMPR1A的基因突變與胰腺癌的發(fā)生顯著相關(guān)，然而這些基因編碼的蛋白表達(dá)與胰腺癌之間的相關(guān)性較弱。此外，根據(jù)Integrative Onco Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，這16個(gè)突變基因中，HRAS、IL6ST、EIF3E、NSD1以及MYH9的作用方式為癌基因的激活。剩余的基因中，除了HSPG2的作用方式尚不確定，其余基因的作用方式均為失去抑癌基因的功能，見(jiàn)表4。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的基因突變或表達(dá)水平與腫瘤之間的關(guān)系，我們檢索了表4中16個(gè)突變基因與胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌以及胰腺癌的相關(guān)性研究。結(jié)果顯示，有相當(dāng)一部分MS/ES排名靠前基因的突變或表達(dá)水平與腫瘤之間的關(guān)系在研究中得到證實(shí)。以上數(shù)據(jù)表明，數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的基因突變或表達(dá)水平的排名與腫瘤的相關(guān)性準(zhǔn)確性較高，具有較強(qiáng)的參考價(jià)值。

表4 胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌及胰腺癌中16個(gè)突變基因的突變與表達(dá)評(píng)分在31種腫瘤類型中的排名情況Table 4 Ranking of mutation and expression scores of 16 mutant genes in gastric cancer,colorectal cancer,liver cancer and pancreatic cancer among 31 tumor types

3 討論

眾所周知，基因突變與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系密切，越來(lái)越多的研究找到了與腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵突變基因，使得它們成為抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。有研究通過(guò)對(duì)數(shù)百名不同類型腫瘤患者的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的深入分析，找到了SF3B1的基因突變?cè)诎籽?、骨髓增生異常綜合征、黑色素瘤、乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生中的作用[24]。此外，盡管腫瘤是一種高度異質(zhì)性的疾病，不同腫瘤之間的突變?nèi)匀淮嬖谙嗨菩?。研究者們?cè)趯?duì)乳腺癌樣本的全基因組測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)了一種可能與肺癌發(fā)生密切相關(guān)的PTPRH基因的突變[25]。因此，腫瘤中的突變基因是尋找抗腫瘤藥物治療靶點(diǎn)的重要途徑之一。

流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，中國(guó)人群中胃癌、食管癌、肝癌、結(jié)直腸癌以及胰腺癌的發(fā)病率及死亡率均非常高[26]。然而，針對(duì)這一系列腫瘤的治療手段迄今仍然非常有限。根據(jù)2020年CSCO臨床診療指南推薦，除了原發(fā)性肝癌外，另外4種消化系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤的藥物治療仍然是以氟尿嘧啶、鉑類、紫杉類等化療藥物為主。獲批用于以上4種腫瘤的靶向治療藥物僅有靶向HER2的曲妥珠單抗、靶向BRAF的達(dá)拉非尼、靶向MEK的曲美替尼、靶向VEGFR的貝伐珠單抗、雷莫蘆單抗、阿帕替尼以及基于PD-1/PD-L1的免疫療法。因此，在藥物治療方面，消化系統(tǒng)腫瘤是未滿足臨床需求的大適應(yīng)證，開(kāi)發(fā)新的藥物治療方法任重道遠(yuǎn)。

本研究對(duì)五種常見(jiàn)消化系統(tǒng)腫瘤排名前10的突變基因Venn分析結(jié)果顯示，消化系統(tǒng)各常見(jiàn)腫瘤間具有一定的同質(zhì)性。此外，在胃癌以及肝癌中，原位與轉(zhuǎn)移性腫瘤中基因突變的差異較大。相反，在食管癌、結(jié)直腸癌以及胰腺癌中，原位與轉(zhuǎn)移性腫瘤中的基因突變則較為相似。由于轉(zhuǎn)移性腫瘤異質(zhì)性強(qiáng)、惡性程度高、患者預(yù)后差，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中特異的基因突變相對(duì)原位腫瘤更具生物學(xué)意義，具備成為腫瘤轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物及抗腫瘤藥物靶點(diǎn)的潛力。

如何從眾多突變的基因中找到治療性藥物開(kāi)發(fā)的目標(biāo)是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作，尋找有效的、高效的、系統(tǒng)的篩選方法至關(guān)重要。英國(guó)癌癥研究所開(kāi)發(fā)的canSAR數(shù)據(jù)庫(kù)匯集了生物、化學(xué)及藥理等多個(gè)學(xué)科的數(shù)據(jù)，能夠從生物學(xué)、化學(xué)、空間結(jié)構(gòu)等多個(gè)維度來(lái)綜合評(píng)估基因的成藥性[27]。由于目前已上市的或正在研究的靶向藥物靶點(diǎn)多是蛋白質(zhì)，因此，本研究的主要目標(biāo)是這些突變基因編碼的蛋白質(zhì)。基于canSAR數(shù)據(jù)庫(kù)中的亞細(xì)胞分布、癌癥相關(guān)評(píng)分、可成藥3D結(jié)構(gòu)數(shù)目（小分子）、可與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域數(shù)量（小分子）、活性小分子數(shù)量、基于化學(xué)的評(píng)分以及抗體藥物成藥性評(píng)估等多個(gè)參數(shù)對(duì)40個(gè)突變基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗癌藥物靶點(diǎn)成藥性分析，最終篩選到17個(gè)具備作為抗癌藥物開(kāi)發(fā)潛在靶點(diǎn)的突變基因編碼的蛋白。在最終篩選到的17個(gè)基因中，SMAD4、BMPR1A以及IL6ST的基因突變?cè)u(píng)分至少在3種消化系統(tǒng)腫瘤中的排名較為靠前。以這三個(gè)基因?yàn)槔殚喴运鼈優(yōu)榘悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物研發(fā)進(jìn)展。以SMAD4為靶點(diǎn)的兩個(gè)抗腫瘤治療專利均作用于SMAD4的基因水平，以基因調(diào)節(jié)劑或激活劑發(fā)揮作用，治療形式均為生物治療。IL6ST基因編碼的蛋白為IL-6Rβ（CD130），共找到6篇作用于該蛋白的生物治療專利文章，然而這些專利的適應(yīng)證多為免疫相關(guān)疾病。由于其與多種消化系統(tǒng)腫瘤之間密切聯(lián)系，開(kāi)展其在腫瘤適應(yīng)證中的生物學(xué)驗(yàn)證極具意義。未找到以BMPR1A為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療專利或研究，其或許可作為消化系統(tǒng)腫瘤的新治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究從消化系統(tǒng)5種常見(jiàn)腫瘤的突變基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，通過(guò)canSAR數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)未有研究的突變基因或其編碼的蛋白進(jìn)行成藥性分析，找到能夠用于后續(xù)抗腫瘤新藥開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)。該方法適用于基于差異表達(dá)基因/蛋白數(shù)據(jù)集的成藥性分析。然而該方法也存在一些不足，比如針對(duì)突變基因編碼的蛋白質(zhì)的成藥性分析，該蛋白為野生型蛋白，不能完全代表突變基因的功能。此外，對(duì)于成藥性分析的參數(shù)設(shè)置較為主觀，這個(gè)問(wèn)題還需要將參數(shù)調(diào)整后的分析結(jié)果多方驗(yàn)證才能夠形成較為成熟的方案，有待后續(xù)工作來(lái)實(shí)現(xiàn)。盡管存在一定的不足，在腫瘤治療嚴(yán)重未滿足臨床需求的現(xiàn)狀下，該方法的運(yùn)用能夠?yàn)閷ふ倚碌目鼓[瘤藥物治療靶點(diǎn)提供較為堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)，為新藥的研究者們減少潛在靶點(diǎn)的篩選成本與時(shí)間。