劉長(zhǎng)健，王健，劉紹嚴(yán)

0 引言

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的腫瘤之一，主要起源于喉部黏膜的上皮組織，并且大多數(shù)是鱗狀細(xì)胞癌[1]。雖然相對(duì)于其他腫瘤來(lái)說(shuō)，喉癌的發(fā)病率和死亡率較低，但是無(wú)論是在中國(guó)還是其他國(guó)家均呈上升趨勢(shì)[1-4]。喉癌常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素有許多，包括吸煙、胃食管反流、飲酒和石棉暴露[5]。盡管喉癌的診斷和治療方法有了不斷改進(jìn)，但由于喉癌發(fā)病隱匿并且復(fù)發(fā)率很高，因此，患者總體生存率并沒(méi)有得到明顯提高[6]。這就需要更加有效的預(yù)測(cè)和治療的靶點(diǎn)。

在過(guò)去的幾年里，對(duì)細(xì)胞焦亡的研究越來(lái)越多。焦亡是一種由炎性小體觸發(fā)的炎性細(xì)胞死亡，可導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜溶解，染色質(zhì)碎裂和細(xì)胞內(nèi)促炎內(nèi)容物的釋放。據(jù)報(bào)道，焦亡與動(dòng)脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)[7-8]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)焦亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。因此，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生焦亡將為腫瘤的治療開(kāi)辟新的途徑[9]。另外，lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄本。LncRNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但是它可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[10]。目前，關(guān)于焦亡相關(guān)lncRNA的研究很少。最近的一項(xiàng)研究表明，lncRNA HOTTIP在卵巢癌中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且沉默HOTTIP后可導(dǎo)致NLRP1炎性反應(yīng)小體介導(dǎo)的焦亡[11]。同樣，沉默lncRNA SNHG可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生焦亡[12]。

因此本研究擬基于TCGA數(shù)據(jù)構(gòu)建與焦亡相關(guān)lncRNA的預(yù)后模型，并對(duì)該模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)GSEA富集預(yù)測(cè)該模型可能參與的信號(hào)通路。結(jié)果表明這種新的預(yù)后模型可以很好地預(yù)測(cè)喉癌的預(yù)后，從而有助于確定治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcgadata.nci.nih.gov/）中獲取喉癌患者的轉(zhuǎn)錄組和臨床資料數(shù)據(jù)（12例正常組織和111例癌組織）。然后從MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）和文獻(xiàn)[13]中獲得了57個(gè)焦亡相關(guān)的基因。

1.2 獲取差異表達(dá)的與焦亡相關(guān)lncRNA

采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)評(píng)估焦亡基因與相關(guān)lncRNA之間的關(guān)系。相關(guān)系數(shù)＞0.4并且P＜0.01。使用Wilcox秩和檢驗(yàn)得到差異表達(dá)的與焦亡相關(guān)lncRNA（FDR＜0.05,|logFC| ＞1）。

1.3 建立預(yù)后模型

首先，將上述獲得的lncRNA進(jìn)行單因素Cox分析，獲得與預(yù)后有關(guān)的lncRNA（P＜0.05）。隨后，使用多因素Cox逐步回歸法構(gòu)建預(yù)后模型。依據(jù)每個(gè)lncRNA的回歸系數(shù)，構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方程：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=β1×lncRNA1EXP+β2×lncRNA2EXP+......+βn×lncRNAnEXP，式中β為相應(yīng)lncRNA的回歸系數(shù)，lncRNAEXP為相應(yīng)lncRNA的表達(dá)量[14]。依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值，將喉癌患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者總生存的關(guān)系。采用ROC曲線(xiàn)比較預(yù)后模型的準(zhǔn)確性。使用R軟件的“pheatmap”包繪制預(yù)后模型中l(wèi)ncRNA表達(dá)熱圖。將臨床數(shù)據(jù)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)合并進(jìn)行獨(dú)立預(yù)后分析。此外，使用Cytoscape3.6.0可視化lncRNA與焦亡基因之間的互作關(guān)系。

1.4 基因富集分析

使用GSEA4.0.0進(jìn)行富集分析，首先根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值將其分成高、低風(fēng)險(xiǎn)組。選用GSEA中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt數(shù)據(jù)集作為內(nèi)參照，運(yùn)用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行富集分析并設(shè)置1 000次隨機(jī)組合。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析使用R4.0.0和SPSS24.0。兩組之間的差異比較使用Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行分析?；贔DR并采用Benjamini-Hochberg法進(jìn)行校正鑒定表達(dá)差異的lncRNA。使用ROC曲線(xiàn)評(píng)估預(yù)后模型的敏感度和特異性。Spearman相關(guān)檢驗(yàn)分析基因表達(dá)間的相關(guān)性。生存曲線(xiàn)比較采用Kaplan-Meier法和Log rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 焦亡相關(guān)lncRNA預(yù)后基因集

共發(fā)現(xiàn)483個(gè)與焦亡相關(guān)的lncRNA。單因素Cox分析確定了23個(gè)有預(yù)后價(jià)值的焦亡相關(guān)lncRNA，將這23個(gè)lncRNA納入多因素Cox逐步回歸分析中。最終，有10個(gè)焦亡相關(guān)lncRNA被認(rèn)為是喉癌的獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)因子，見(jiàn)表1。計(jì)算10個(gè)lncRNA的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分并構(gòu)建了預(yù)后模型，并使用R軟件的“pheatmap”包繪制預(yù)后模型中l(wèi)ncRNA表達(dá)熱圖，見(jiàn)圖1。

表1 預(yù)后模型中的10個(gè)lncRNAsTable 1 Ten lncRNAs in prognostic model

2.2 高風(fēng)險(xiǎn)組與較差的生存有關(guān)

Kaplan-Meier分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組與較差的生存率相關(guān)（P＜0.001），見(jiàn)圖2A。風(fēng)險(xiǎn)生存狀態(tài)圖提示：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與喉癌患者的生存率成反比，見(jiàn)圖2B。新的lncRNA預(yù)后模型對(duì)喉癌1、3、5年生存率的AUC預(yù)測(cè)值分別為0.864、0.866和0.806，見(jiàn)圖2C。單因素分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（HR=1.075,95%CI:1.045～1.107,P＜0.001）和性別（HR=0.292,95%CI:0.133～0.641,P=0.002）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；多因素Cox分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（HR=1.056,95%CI:1.022～1.092,P=0.001）和性別（HR=0.351,95%CI:0.128～0.968,P=0.043）同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和性別是影響喉癌患者總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素，見(jiàn)圖3A～B。預(yù)后模型中l(wèi)ncRNA與mRNA的作用關(guān)系，見(jiàn)圖3C，其中AC015911.3所調(diào)控的焦亡基因數(shù)目最多，處于核心地位，推測(cè)其可能在喉癌發(fā)生焦亡的過(guò)程中扮演著重要角色。結(jié)合臨床病理特征和新的焦亡相關(guān)lncRNA預(yù)后模型的列線(xiàn)圖進(jìn)一步證明了該預(yù)測(cè)模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，即風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分越高，患者的生存越差，見(jiàn)圖3D。綜上所述，該預(yù)后模型可應(yīng)用于喉癌患者的臨床診斷和治療。

2.3 富集分析

為探究風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)的生物學(xué)通路，對(duì)高、低分析組進(jìn)行了基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA），結(jié)果表明，低風(fēng)險(xiǎn)組樣本顯著富集到纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解（FDR=0.145,P=0.002）和丁酸甲酯代謝（FDR=0.196,P＜0.001）等基因集，見(jiàn)圖4。因此，焦亡相關(guān)lncRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞代謝相關(guān)通路進(jìn)而調(diào)控其增殖。

3 討論

焦亡可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感度，為腫瘤的治療指明了新的方向。在本研究中，首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)確定了與焦亡相關(guān)預(yù)后lncRNA，并建立了喉癌的預(yù)后模型。然后使用GSEA對(duì)高、低危險(xiǎn)組進(jìn)行了通路富集分析。本研究發(fā)現(xiàn)了焦亡信號(hào)通路中潛在的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)10個(gè)差異表達(dá)的焦亡相關(guān)lncRNA是喉癌的獨(dú)立預(yù)后因素。近期的研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌中過(guò)表達(dá)的LINC02454可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡并促進(jìn)其增殖，與腫瘤體積和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。在鼻咽癌、食管癌和骨肉瘤中，NKILA可以作為抑癌基因通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路抑制腫瘤的進(jìn)展[16-18]。同樣，NKILA在喉癌中的低表達(dá)與喉癌患者較短的總生存期有關(guān)，并且敲降NKILA可以抑制NF-κB的活化，降低了X-射線(xiàn)輻射對(duì)喉癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[19]。在一項(xiàng)相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中表達(dá)上調(diào)的ERICD與預(yù)后不良有關(guān)，并通過(guò)E2F1與ARID3A相互作用，調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的遷移和增殖[20]。MIR9-3HG是原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的保護(hù)因素[21]。然而，關(guān)于焦亡相關(guān)lncRNA在喉癌預(yù)后中的價(jià)值研究甚少。

本研究利用焦亡相關(guān)lncRNA構(gòu)建預(yù)后模型，并計(jì)算出每例患者的危險(xiǎn)評(píng)分，按照風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位值將所有患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組，以探討他們?cè)诤戆┲械臐撛谧饔?。利用GSEA軟件進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解和丁酸甲酯代謝等基因集顯著富集到低風(fēng)險(xiǎn)組。研究發(fā)現(xiàn)，3-羥基異丁基CoA水解酶作為纈氨酸分解代謝的關(guān)鍵酶，在被抑制后可以控制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[22]。此外，生長(zhǎng)因子激活的PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)LAT3調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞系中亮氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，這能使前列腺癌細(xì)胞系快速攝取亮氨酸以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[23]?？傊?，焦亡相關(guān)lncRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞代謝調(diào)控其增殖。

焦亡是一種新的細(xì)胞死亡形式，可能為腫瘤治療提供新的途徑。然而，許多關(guān)鍵問(wèn)題仍然沒(méi)有解決，如焦亡和其他細(xì)胞死亡之間的聯(lián)系，以及如何通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞代謝影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，本研究的探索有助于預(yù)測(cè)與喉癌預(yù)后有關(guān)的焦亡相關(guān)lncRNA的生物標(biāo)志物，為相關(guān)疾病的治療提供依據(jù)。本研究還有許多不足，如樣本量不足，還需要使用不同的隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證；研究結(jié)果沒(méi)有經(jīng)過(guò)臨床樣本的驗(yàn)證，可靠性無(wú)法得到充分保證。