王玉秀，陳燏，龔道輝，曹柳兆，許文景，徐興祥，閔凌峰

0 引言

肺癌是我國常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人民群眾的生命健康，其中85%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1]。盡管手術切除、局部消融、血管介入及分子靶向治療在肺癌的治療中已取得飛速發(fā)展，但總體上肺癌患者仍然預后不良。因此研究NSCLC發(fā)生及發(fā)展的分子機制，為臨床尋找新的治療方法有著重要的意義。

FUN14結構域包含體蛋白（FUN14 domaincontaining protein 1,FUNDC1）作為線粒體受體家族中的最重要成員之一[2]，由155個氨基酸組成，隸屬于FUN14家族，在人類染色體上定位于X染色體1區(qū)1亞區(qū)3帶，F(xiàn)UNDC1的蛋白質序列從果蠅到人類高度保守[3-4]。有學者認為，F(xiàn)UNDC1作為一個完整的線粒體膜蛋白，在線粒體自噬的過程中扮演了受體的角色[5]。FUNDC1的異常表達能夠影響到線粒體正常的自噬調節(jié)，從而影響腫瘤細胞的能量代謝，最終調控腫瘤的發(fā)生[6]。

目前，關于FUNDC1的蛋白表達在線粒體自噬以及腫瘤方面的基礎研究較多，而其與患者臨床病理特征以及預后的相關性研究報道較少。本研究旨在探討其與NSCLC的相關性，明確其對NSCLC的預后分析是否有一定的指導價值。

1 資料與方法

1.1 生物信息學分析

使用TCGA（The Cancer Genome Atlas Program,TCGA）數(shù)據(jù)庫的所有肺腺癌和肺鱗狀細胞癌樣本的RNA-seq v2數(shù)據(jù)，共納入肺腺癌579例和肺鱗狀細胞癌553例。

1.2 臨床資料

收集2012年6月—2017年9月在江蘇省靖江市人民醫(yī)院行根治手術并經病理確診為NSCLC患者的石蠟切片樣本（癌旁正常組織和癌組織），共68例，其中男49例，女19例，＞60歲43例，≤60歲25例，患者平均年齡（64.3±10.9）歲。

納入標準：（1）經病理學證實為非小細胞肺癌；（2）所有患者化療前未接受過任何抗腫瘤治療；（3）年齡18～70歲，Karnofsky評分≥70分，預計生存期＞3月；（4）至少有一個經影像學證實的可測量病灶；（5）血常規(guī)、肝腎功能、心電圖均正常，無化療禁忌證?；颊叩乃劳鲈蚓c非小細胞肺癌密切相關。所有患者均簽署知情同意書。并經江蘇省靖江市人民醫(yī)院倫理委員會批準。

排除標準：（1）年齡＞85歲、或合并有嚴重心腦血管并發(fā)癥不能手術患者；（2）合并其他器官惡性腫瘤患者；（3）術前接受放療、化療或其他針對腫瘤治療的患者；（4）依存性差不能配合隨訪的患者。

1.3 免疫組織化學檢測

標本經過福爾馬林固定、脫水、包埋，4 μm連續(xù)切片，應用MaxVision法進行免疫組織化學分析。兔抗人FUNDC1單克隆抗體購自美國Epitomics公司，通用免疫組織化學MaxVision試劑盒和DAB顯色試劑購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。FUNDC1抗體工作濃度為1:50，具體染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 免疫組織化學結果判定

參考近期國外文獻[7-8]方法，觀察FUNDC1蛋白的分布、陽性強度和陽性表達情況。免疫組織化學結果判斷采用雙盲法，由兩位資深病理科醫(yī)師對組織芯片上每個芯片的染色結果進行評價。在高倍顯微鏡下（×400）分別對每個位點計數(shù)100個細胞，每個組織選取400個，按操作規(guī)范分別記錄染色陽性細胞密度及抗體染色的強度。如果遇到各代表位點染色差異較大，則另取該例標本的常規(guī)切片觀察。FUNDC1蛋白定位于細胞胞質，呈棕黃色顆粒狀為陽性。根據(jù)染色陽性非小細胞肺癌細胞數(shù)目所占百分比來統(tǒng)計：沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞為0分，1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%～100%為4分。染色強度按腫瘤細胞著色的深淺計分：陰性為0分，弱陽性為1分，強陽性為2分。最后依據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)目百分比的乘積（4分以上為高表達），得出每例標本的得分，0～3分為陰性，4～8分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計分析使用SPSS22.0軟件，NSCLC患者的存活時間與線粒體受體（DRP1、BNIP3、FUNDC1、NIX、RHEB、LC3、OPA1、MFN1）的分析采用Kaplan-Meier曲線法，用Log rank檢驗生存率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。對于連續(xù)型的變量采用雙側t檢驗來確定差異是否具有統(tǒng)計學意義。肺癌患者的臨床特征相關的指標分析采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。多因素回歸分析來確定非小細胞肺癌的獨立危險因子。

2 結果

2.1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析正常組織與非小細胞肺癌組織中線粒體受體表達差異

與正常組織相比，非小細胞肺癌組織FUNDC1的表達明顯上調（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義，見圖1，而其余線粒體受體（DRP1、BNIP3、NIX、RHEB、LC3、OPA1、MFN1）的表達在兩組之間未見明顯差異（圖請掃描本文OSID碼）。

非小細胞肺癌組織中FUNDC1表達與患者的總生存期（OS）和無復發(fā)生存期（RFS）均相關（P=0.047,P=0.048）；FUNDC1低表達者OS和RFS均優(yōu)于高表達者，見圖2。而其他線粒體受體蛋白表達與預后之間無明顯相關性（均P＞0.05）（圖請掃描本文OSID碼）。

2.2 FUNDC1在非小細胞肺癌患者組織中的表達

免疫組織化學染色結果顯示，F(xiàn)UNDC1在非小細胞肺癌組織中廣泛表達，主要定位于細胞質；再利用Image-Pro Plus軟件對免疫組織化學結果進行相對定量，結果顯示FUNDC1表達在非小細胞肺癌組織中明顯高于正常組織，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

2.3 FUNDC1的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關系

根據(jù)免疫組織化學結果分為FUNDC1低表達組28例（41.2%）和高表達組40例（58.8%）。非小細胞肺癌組織中FUNDC1表達與患者區(qū)域淋巴結轉移和分化程度明顯相關（均P＜0.05），與患者的年齡、性別、病理分型、遠處轉移、TNM分期均無相關性（均P＞0.05），見表1。

表1 68例非小細胞肺癌患者組織中FUNDC1的表達與患者臨床病理特征的關系Table 1 Relation between FUNDC1 expression and clinicopathological characteristics of 68 NSCLC patients

Cox回歸分析顯示，年齡、性別、病理分型、遠處轉移、TNM分期不能作為預測患者預后的獨立危險因子，F(xiàn)UNDC1蛋白表達、區(qū)域淋巴結轉移、病理分化程度是非小細胞肺癌患者的獨立預后因子，見表2。

表2 非小細胞肺癌中潛在預后因素的Cox回歸分析Table 2 Cox regression analysis of potential prognostic factors for NSCLC

2.4 68例非小細胞肺癌患者組織中FUNDC1的表達與患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析顯示，40例FUNDC1高表達組中的非小細胞肺癌患者有16例發(fā)生疾病進展，中位PFS為4.5月；而28例低表達組中僅有5例出現(xiàn)了疾病進展，中位PFS為19月；FUNDC1低表達者PFS均優(yōu)于高表達者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。40例FUNDC1高表達組中的非小細胞肺癌患者有33例疾病死亡，中位OS為23.5月；而28例低表達組中僅有13例出現(xiàn)了疾病死亡，中位OS為41.5月；FUNDC1低表達者OS均優(yōu)于高表達者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。

3 討論

線粒體的受體蛋白作為新近發(fā)現(xiàn)的影響線粒體自噬過程的家族蛋白[9]，在腫瘤進展過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。目前共發(fā)現(xiàn)DRP1、BNIP3、FUNDC1、NIX、RHEB、LC3、OPA1和MFN1等8個成員，而FUNDC1作為線粒體受體家族中成員之一，可重編程腫瘤細胞的線粒體動力學、氧化生物能學和氧化還原平衡，從而在腫瘤細胞增殖以及侵襲中扮演著重要的角色[10]。FUNDC1是一種高度保守的線粒體外膜蛋白，被鑒定為一種線粒體自噬受體，可在缺氧條件下直接與自噬微管相關蛋白LC3結合[11]。而在腫瘤細胞中，F(xiàn)UNDC1和LC3的結合會直接影響線粒體功能的穩(wěn)定，從而影響腫瘤細胞的能量代謝以及對葡萄糖的攝取能力，從而在腫瘤細胞惡性程度中起一定作用[12]。然而長期吸煙作為NSCLC最主要的獨立危險因素之一，缺氧是NSCLC患者常有的狀態(tài)，那么FUNDC1在其中是否有一定的作用？本研究依據(jù)FUNDC1的生物學特性，基于TCGA數(shù)據(jù)庫以及臨床病理學特征深入探究了FUNDC1在非小細胞肺癌臨床特性以及預后中的影響。

線粒體膜結合的FUNDC1蛋白作為一種線粒體自噬的調節(jié)因子，可以激活腫瘤細胞的自噬，起到促癌基因的作用[13]，并且Hou等[14]于2017年發(fā)現(xiàn)FUNDC1在宮頸癌中表達明顯上調，且其高表達與宮頸癌患者預后呈負相關，可作為總生存期和無病生存期的獨立預后影響因素。Hui等[15]在喉癌細胞以及組織中均發(fā)現(xiàn)FUNDC1高表達，且過氧化氫通過激活ERK1/2信號上調FUNDC1的表達，從而觸發(fā)線粒體自噬反應，使喉癌細胞適應生存。同時在神經母細胞瘤中，同樣發(fā)現(xiàn)FUNDC1過表達并誘導線粒體自噬的發(fā)生[16]?；谝陨涎芯拷Y果，我們明確了FUNDC1蛋白在非小細胞肺癌高表達，也許是通過觸發(fā)線粒體自噬反應促進非小細胞肺癌細胞的生存適應以及增殖而增強其侵襲性以及遠處轉移。

本研究進一步探索了FUNDC1表達上調與非小細胞患者臨床病理學特征之間的相關性，結果顯示FUNDC1的表達上調與患者區(qū)域淋巴結轉移和分化程度有明顯相關性。另外，Cox回歸分析顯示，F(xiàn)UNDC1蛋白表達、區(qū)域淋巴結轉移、病理分化程度均是非小細胞肺癌患者的獨立預后危險因子，F(xiàn)UNDC1表達的上調與患者總體生存率以及無進展生存率的下降存在明顯相關性。FUNDC1表達上調影響患者預后的研究，同樣在其他腫瘤類型中也有研究，例如喉癌[15]和宮頸癌[14]等。結合本研究結果，F(xiàn)UNDC1表達上調促進非小細胞肺癌患者腫瘤侵襲以及降低患者預后的作用明確，但具體作用機制目前尚不明確，據(jù)推測，F(xiàn)UNDC1依賴的自噬可能是由缺氧觸發(fā)的，其方式嚴重依賴于缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor 1a,HIF-1α），其可被認為是一種清除劑，以中和ROS，這對癌癥的發(fā)展至關重要；除了抗氧化特性外，F(xiàn)UNDC1相關的自噬還可以在轉錄和翻譯后水平上感知并傳遞許多應激信號，如炎性反應、營養(yǎng)底物轉換或免疫調節(jié)等，最終影響腫瘤代謝、增殖、突變、免疫動員分化和轉移[17-19]。有學者提出，基于FUNDC1在線粒體自噬中的獨立作用，可通過FUNDC1-LonP1軸的線粒體重組過程在腫瘤的增殖和侵襲狀態(tài)之間切換來控制腫瘤細胞的可塑性[10]。FUNDC1的異常表達促進了線粒體膜電位的缺失以及線粒體片段的自噬，影響了凋亡信號通路的相關分子BCL-xL，從而抑制了腫瘤細胞的凋亡[20]。FUNDC1的異常表達是否通過誘導線粒體自噬的發(fā)生將是我們下一步研究的方向。

本研究首次檢測了非小細胞肺癌患者腫瘤組織中FUNDC1的表達譜，發(fā)現(xiàn)高FUNDC1表達可作為患者不良預后的獨立預測因子，具有潛在的癌基因特征，因此，F(xiàn)UNDC1可能成為非小細胞肺癌等腫瘤新的治療靶點。