周 健 ，曹婷婷 ，2，曹俊新 ，趙云翔 ，2＊

（1.廣西貴港秀博基因科技股份有限公司，廣西 貴港 537100；2.佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，廣東 佛山528000）

1 前言

隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)中不斷推廣和應(yīng)用，很大程度上提升了生產(chǎn)效率和公豬利用率，增加了養(yǎng)殖效益，并在一定程度上降低了某些疾病的傳播風險，深受養(yǎng)豬企業(yè)喜歡。然而，人工授精技術(shù)的充分發(fā)展與精液是否能長期有效保存關(guān)系十分密切。豬精液冷凍保存技術(shù)可以解決豬精不能長期保存的困擾，目前公豬精液冷凍技術(shù)國內(nèi)外均有研究，雖然均取得了一定突破，但操作難度大、且在受胎率、產(chǎn)仔數(shù)方面都低于鮮精，這也是制約凍精推廣的主要因素。當前非洲豬瘟肆意傳播，豬場防控形勢非常嚴峻，引種難度加大，使用凍精引種可以多環(huán)節(jié)多層次進行病原學檢測，大大降低疾病帶來的風險，并且可以保存優(yōu)秀公豬基因，在保種方面具有很大的優(yōu)越性。1956年，Polge等首次成功進行豬精液的冷凍和保存，并利用人工授精技術(shù)獲得仔豬，之后各國學者在豬精冷凍上開始了大量的研究，目前豬精冷凍方式主要分為程序冷凍和熏蒸冷凍兩種，本研究通過比較兩種冷凍方式對豬精的冷凍效果，以期待在保證冷凍效果的前提下利用程序冷凍儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)熏蒸冷凍，來進行大規(guī)模公豬凍精批量化生產(chǎn)；當前豬凍精規(guī)格多數(shù)采用0.5 mL/支，雖然小規(guī)格有利于凍精生產(chǎn)和復(fù)蘇，但在豬場實際應(yīng)用較為不方便，尤其是單支解凍不利于豬場實際配種操作，目前尚未見到批量解凍凍精的報道，所以本文批量解凍實驗希望能夠提高凍精實際應(yīng)用效率，以便更有利于凍精的推廣應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 實驗動物及實驗精液

沈陽秀博種豬繁育科技有限公司成年純種公豬24頭，體質(zhì)健壯，性欲旺盛。原精要求：精子活力≥90%，精子密度≥2億/mL，精子畸形率≤10%。

2.2 主要實驗儀器與試劑

TurboFreezerM程序冷凍儀（米尼圖），HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華），EasyCoder2.0色帶打印機（米尼圖），KDC-2046低速冷凍離心機（安徽中科），冷凍精子平衡柜（米尼圖），精子檢測分析儀（IVOS-II，IMV），單頭灌裝機MPPUno（米尼圖）、0.5 mL凍精細管（米尼圖）、熏蒸架（田園奧瑞），自制批量解凍器。甘油（Sigma），乳化劑Equex-Paste（米尼圖），基礎(chǔ)稀釋粉Androstar?CryoPlus，新鮮卵黃。

2.3 冷凍保護液配制

首先在1 000 mL的燒杯中準確倒入770 mL超純水，在磁力攪拌器上攪拌并加熱至34℃，此時緩緩倒入Androstar?CryoPlus基礎(chǔ)稀釋粉，充分攪拌溶解，待溶液pH穩(wěn)定后加200 mL新鮮卵黃并充分攪拌溶解，取出500 mL作為冷卻液；向剩余溶液中添加30 mL甘油和5 g乳化劑Equex-Paste，充分攪拌溶解后作為冷凍液。

2.4 精液冷凍處理

本實驗主要采用熏蒸冷凍和程序冷凍來進行凍精實驗，熏蒸冷凍條件為液氮面距離凍精細管橫截面中心3 cm，密閉熏蒸8 min；程序冷凍采用表1的冷凍曲線進行操作。檢測合格的原精使用常溫保存稀釋液進行1～2倍等溫稀釋，梯度降溫至17℃，在此溫度下900 g離心20 min，抽棄上清液后添加冷卻液，充分懸浮后放置5℃平衡柜中平衡3 h，待精液溫度降至5℃后添加冷凍液，調(diào)整精液濃度為8億/mL，充分懸浮后進行灌裝，之后分別進行熏蒸冷凍和程序冷凍。

表1 精液冷凍降溫程序

2.5 解凍與檢測

本實驗采用50℃水浴16 s進行解凍，批量解凍實驗共分為9個實驗組，即單支解凍組（T1）、雙支解凍組（T2），3支解凍組（T3），4支解凍組（T4），5支解凍組（T5），6支解凍組（T6），7支解凍組（T7），8支解凍組（T8），9支解凍組（T9），使用自制的批量解凍器依次解凍9個實驗組凍精，每次解凍后需擦干批量解凍器，方可進行下一批次解凍，不可留有水滴，若有水滴會影響解凍效果。解凍后使用精液分析儀（IVOS-II）檢測精子活力和前向精子。

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)先使用 Excel處理，再使用 SAS 9.2軟件進行單因素方差檢驗，結(jié)果以“平均值±標準差“表示，P＜0.05表示差異顯著。

4 結(jié)果與分析

不同冷凍方法對凍精活力和前向精子的影響，詳見表2。由表2可知，熏蒸冷凍組解凍后精子活力（65.961±7.733）與程序冷凍組（70.100±8.755）差異不顯著（P＞0.05）；解凍后前向精子占比兩組之間也沒有顯著差異（P＞0.05），但程序冷凍組在數(shù)值上偏高。

表2 不同冷凍方法對凍精活力和前向精子的影響

批量解凍不同數(shù)量凍精細管，精子活力和前向精子結(jié)果如表3。由表3可知，解凍后精子活力方面，T3組精子活力（70.038±14.458）顯著高于T9組（57.485±9.321）（P＜0.05），但是T3組和T9組分別與其余各組在解凍后精子活力上差異不顯著（P＞0.05）；解凍后前向精子方面，T1組（36.062±11.326）、T3組（38.308±11.547）、T5組（36.600±10.204）均顯著高于T9組（23.738±7.689）（P＜0.05），但與其余組之間均沒有顯著差異（P＞0.05），T9組與T2、T4、T6、T7、T8組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 0.5 mL凍精細管批量解凍后精子活力和前向精子檢測結(jié)果

5 討論

5.1 熏蒸冷凍與程序冷凍對復(fù)蘇后精子活力和前向精子的影響

目前國內(nèi)外精液冷凍主要采取兩種方法，即熏蒸法和程序冷凍法，兩種方法在不同動物上均已廣泛使用。眾所周知，精子在冷凍過程中面臨著冰晶、滲透壓及活性氧（ROS）的威脅，以一定的降溫速率來冷凍精子，使其安全通過危險區(qū)對精子冷凍至關(guān)重要。研究表明，冷凍過程中水分子玻璃化狀態(tài)下最有利于精子保存，對精子的理化損傷最小。熏蒸法冷凍雖然也取得了一些良好的冷凍效果，但由于其客觀因素影響較大，其對降溫速率主觀干預(yù)性較差，而程序冷凍可以做到對冷凍曲線實時監(jiān)控，人為主觀調(diào)控力強，使實際降溫速率最大限度地按照設(shè)定的速率進行，保證降溫速率穩(wěn)定進行，理論上可以增加不同批次間冷凍效果的穩(wěn)定性。雖然實驗1復(fù)蘇后的精子活力和前向精子占比在統(tǒng)計學上無顯著差異，但在數(shù)值上程序冷凍要優(yōu)于熏蒸冷凍，目前很多學者都進行過精液不同方法的冷凍研究。熏蒸時間研究方面，如高俊鋒等研究發(fā)現(xiàn)0.25 mL 細管在液氮面3 cm處熏蒸10 min再投入液氮獲得最佳的冷凍效果；章嘯君等對金華豬精液進行液氮熏蒸冷凍，也得出液氮熏蒸10 min再投入液氮有較好的冷凍效果。在凍精細管熏蒸高度研究上也有很多探索，張偉研究發(fā)現(xiàn)凍精細管距液氮面4 cm冷凍解凍后精子活力、運動速率和質(zhì)膜完整性均達到最佳狀態(tài)，而楊凱的研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)凍精細管距液氮5 cm的冷凍效果優(yōu)于4 cm；周煜研究表明，凍精細管距液氮5 cm冷凍頂體完整率高于2 cm，而距液氮面9 cm熏蒸冷凍效果最差，劉莉的研究與周煜的一致，這些研究結(jié)果的差異可能是由于實驗條件差異所致。Juarez等人使用程序冷凍儀進行公豬精液冷凍也取得了不錯的冷凍效果。

5.2 批量解凍與單支解凍對復(fù)蘇后精子活力和前向精子的影響

眾所周知，凍精解凍過程中的冷凍損傷是不可避免的，如何更好地優(yōu)化解凍程序，增加解凍后精子的存活率是目前凍精應(yīng)用研究的方向之一。根據(jù)豬場實際需求，方便豬凍精在人工授精中的操作性，提高使用效率，特進行了0.5 mL凍精的批量解凍實驗，根據(jù)實驗結(jié)果，同時解凍8支0.5 mL公豬凍精與單支解凍后在精子活力和前向精子占比上均沒有顯著差異（P＞0.05）；當同時解凍9支時，解凍后精子活力和前向精子占比顯著低于單支解凍（P＜0.05），其原因可能是由于放入水浴中的冷源過多，超過最佳升溫速率的上限，無法快速通過-30℃～70℃危險區(qū)，造成精子損傷比例偏大所致。對于凍精解凍，許多學者也進行過探索，郭堂玉等研究表明，采用50℃解凍的豬冷凍精液，精子活率、質(zhì)膜完整率均優(yōu)于37℃和70℃解凍溫度組。Roca等研究采用37℃水浴20 s解凍凍精取得了不錯的效果，與Juare等人的解凍程序相同。Juare等人的研究中重點是冷凍前（17℃～5℃）精液的降溫速率對冷凍效果的影響，其結(jié)果表明冷凍前精液的冷卻降溫速率對解凍后精子總活力沒有影響。據(jù)相關(guān)報道，精子的凍融彈性因其品種品系、精子大小形狀及脂質(zhì)含量等特性而有所不同，所以導(dǎo)致冷凍和解凍程序也不盡相同。Córdova-Izquierdo等人使用不同解凍程序解凍5 mL凍精，其研究結(jié)果表明50℃水浴40 s解凍后精子的運動性高于42℃水浴40 s解凍組。本批量解凍實驗與Córdova-Izquierdo的5 mL解凍實驗在某種程度上可以說明解凍速率對精子復(fù)蘇后的運動性影響較大，在解凍時升溫速率不要超出精子承受的最大限度，在水浴溫度、時間不變的情況下加入過多冷源（0.5 mL凍精細管）會影響精子復(fù)蘇效率，在冷源和解凍時間相同時，降低水浴溫度會影響精子復(fù)蘇效果。Córdova等人研究表明，使用不同程序解凍0.5 mL和5 mL公豬凍精細管解凍后兩者在精子活力上沒有顯著差異，但5 mL解凍后染色質(zhì)穩(wěn)定性顯著高于0.5 mL實驗組。Pei Y等的研究采用37℃水浴45 s進行解凍也取得了比較滿意的效果。無獨有偶，在牛凍精研究中也進行了相似的研究，使用0.25 mL和0.5 mL凍精細管進行冷凍對比，Kang等人的研究表明，0.25 mL公牛凍精解凍后快速運動精子占比（Fast progressive（%））、直線運動速率（VSL （μm/s））、平均速率（VAP （μm/s））顯著高于0.5 mL細管組。Nomura等人使用不同容積冷凍管對日本鰻魚精子進行冷凍研究，研究表明，5 mL細管冷凍日本鰻魚精子與0.25 mL細管相比不會降低精子的運動性。研究人員在眾多物種上都在進行冷凍精子的研究，解凍的程序也不盡相同，本次0.5 mL批量解凍實驗可以為優(yōu)化公豬凍精推廣使用方案提供一定的數(shù)據(jù)支持，有利于當前環(huán)境下優(yōu)秀公豬基因的傳播。

6 結(jié)論

結(jié)論1：使用熏蒸冷凍（距液氮面3 cm，熏蒸8 min）和程序冷凍（使用本文降溫曲線進行冷凍）公豬精液在解凍后精子活力和前向精子占比兩個指標上沒有顯著差異。

結(jié)論2：50℃16 s水浴一次性批量解凍8支以內(nèi)（含8支）0.5 mL凍精細管，解凍后精子活力和前向精子占比與單支解凍均沒有顯著差異，本實驗對豬凍精解凍方法的研究，可為優(yōu)化凍精在豬場應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)支撐。