劉德琴 ，肖 敏 ，盧 昌 ，曹華斌 ，劉 建

（1.江西正邦養(yǎng)殖有限公司，江西 南昌 330096；2.江西正邦農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330096；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045）

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，PED） 是 由 豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起豬的腹瀉、嘔吐、脫水及對(duì)仔豬高致死率的一種接觸性腸道傳染病，豬即使耐過也會(huì)降低經(jīng)濟(jì)效益。20世紀(jì)80年代初PED在我國(guó)陸續(xù)發(fā)生，目前不同階段不同品系的豬只，對(duì)此病均有高度易感性，仔豬死亡率高達(dá)80%～100%。自2010年末開始，我國(guó)豬場(chǎng)陸續(xù)暴發(fā)了由PEDV變異毒株引起的“頑固性腹瀉”疫情，嚴(yán)重影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于PED在現(xiàn)階段未有特效藥能夠治療，在養(yǎng)殖管理中，仔豬免疫防治工作尤為重要。但PEDV的S和M基因可引發(fā)較多變異，蔣新華等、德西措姆等、張?jiān)碌确謩e對(duì)江西地區(qū)、四川地區(qū)和山東地區(qū)的PED病料測(cè)序，發(fā)現(xiàn)各地分離的毒株與早期疫苗株同源性較遠(yuǎn)。因此，篩選和培育出具有良好免疫原性、高毒價(jià)的毒株是疫苗研制成功的關(guān)鍵。本項(xiàng)目組近年來長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)腹瀉疫情的發(fā)生，追蹤變異的PEDV毒株，以臨床分離培養(yǎng)的變異毒株作為候選株，有針對(duì)性地開展疫苗研發(fā)，為豬流行性腹瀉免疫防控提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

采集20個(gè)發(fā)病場(chǎng)病料，發(fā)病豬小腸組織經(jīng)組織勻漿后，采用0.22 μm無菌過濾器（購(gòu)自廣州潔特生物技術(shù)有限公司），過濾后置于-20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)豬場(chǎng)選取試驗(yàn)?zāi)肛i80頭及其所產(chǎn)仔豬。

2 方法

2.1 PEDV分離鑒定

將發(fā)病豬小腸組織勻漿濾液接入單層培養(yǎng)的Vero細(xì)胞內(nèi)，加入含有胰酶的DMEM培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)72 h，收獲培養(yǎng)物作為種毒進(jìn)行傳代，收集細(xì)胞毒。經(jīng)連續(xù)傳代5代后，以RT-PCR法鑒定上清液中是否存在PEDV病毒。對(duì)已分離的石新某場(chǎng)、浛洸某場(chǎng)和永佳河某場(chǎng)毒株，擴(kuò)增其S1基因序列，通過MegAlign等生物信息軟件，對(duì)氨基酸同源性進(jìn)化樹分析。

2.2 PEDV疫苗的研制

將擴(kuò)增的細(xì)胞毒通過超濾濃縮法進(jìn)行濃縮，滅活后對(duì)病毒進(jìn)行無菌檢測(cè)，同時(shí)接種以無血清細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)和去除蛋白技術(shù)培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，確定無細(xì)胞病變，滅活完全，與佐劑以體積1∶1比例均勻混合，利用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)代替轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，制備PEDV滅活疫苗。按《中國(guó)獸藥典》和《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求，對(duì)疫苗進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

2.3 免疫與攻毒保護(hù)試驗(yàn)

試驗(yàn)豬場(chǎng)80頭母豬隨機(jī)分成4組，每組20頭，即商品苗組（細(xì)胞苗）、組織苗組（公司某陽(yáng)性發(fā)病場(chǎng)小腸組織制備）、細(xì)胞苗A組（永佳河：公司湖北某場(chǎng)分離毒+公司廣東某場(chǎng)分離毒）和細(xì)胞苗B組（永佳河+公司東北某場(chǎng)分離毒）。所有組豬只PEDV疫苗按照產(chǎn)前6、4、2周經(jīng)后海穴注射進(jìn)行免疫，其他疫苗按照豬場(chǎng)的常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫，在相同的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下進(jìn)行。母乳飼養(yǎng)5 d后，每頭仔豬口服攻毒（永佳河），劑量為10-7.0TCID50/0.1 mL、每頭仔豬口服2 mL。攻毒后觀察7 d，記錄試驗(yàn)仔豬發(fā)?。▏I吐、水樣腹瀉）及死亡情況，采集腹瀉仔豬糞便，進(jìn)行PEDV抗原RT-PCR檢測(cè)。攻毒試驗(yàn)分組情況見表1。

表1 PEDV疫苗免疫保護(hù)攻毒試驗(yàn)分組方案

3 結(jié)果與分析

3.1 PEDV分離鑒定

經(jīng)鑒定，永佳河某場(chǎng)、廣東某場(chǎng)、東北某場(chǎng)的病料檢測(cè)結(jié)果、傳代鑒定均為陽(yáng)性，且在分離后出現(xiàn)典型病變。根據(jù)測(cè)序結(jié)果表明：廣東某場(chǎng)（hanguang-2016）、東北某場(chǎng)（Shixin-2017）和永佳河某場(chǎng)（Yongjiahe-2015）與國(guó)內(nèi)外流行毒株聚在一簇，都是變異毒株，3個(gè)毒株分別落在不同分支上，并且相互之間的氨基酸同源性低于98%，變異明顯。其分屬不同片區(qū)，所以認(rèn)為不同片區(qū)所流行的毒株存在差異。永佳河某場(chǎng)分離毒株序列接近目前國(guó)內(nèi)流行毒株，因此構(gòu)建廣東某場(chǎng)+永佳河和東北某場(chǎng)+永佳河的二價(jià)疫苗組合（見圖1、圖2）。

圖1 廣東某場(chǎng)、東北某場(chǎng)和永佳河S1基因氨基酸同源性比較

圖2 廣東某場(chǎng)、東北某場(chǎng)和永佳河S1基因氨基酸進(jìn)化分析結(jié)果

3.2 PEDV疫苗的研制

利用生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)代替轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制備的PEDV滅活疫苗成品，抗原滴度可到達(dá)10-7TCID50/0.1 mL。滅活疫苗無菌檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)等各項(xiàng)質(zhì)量檢驗(yàn)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 母豬排毒量

母豬再感染后第2天出現(xiàn)排毒現(xiàn)象（見圖3），第4天后組織苗和細(xì)胞苗B組排毒量較高，直至無檢出。

圖3 母豬再感染排毒情況

3.3.2 母豬初乳中SIgA抗體效價(jià)

四組疫苗免疫后母豬抗體都呈陽(yáng)性，商品苗抗體水平基本穩(wěn)定，組織苗第3天抗體水平顯著上升（P＜0.05），細(xì)胞苗A組和細(xì)胞苗B組抗體水平持續(xù)較高（見圖4）。

圖4 免疫母豬初乳中SIgA抗體檢測(cè)結(jié)果

3.3.3 臨床觀察

攻毒后連續(xù)觀察194 h，仔豬出現(xiàn)腹瀉判斷為發(fā)病。細(xì)胞苗B組腹瀉持續(xù)時(shí)間最短為132 h。攻毒后商品苗組首先出現(xiàn)死亡，死亡率12.5%，組織苗組死亡率2.5%，細(xì)胞苗A組死亡率0，細(xì)胞苗B組死亡率10%（見圖5、圖6、圖7）。

圖5 免疫母豬所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率

圖6 仔豬腹瀉死亡率

圖7 仔豬攻毒后腹瀉指數(shù)

3.3.4 仔豬排毒量

商品苗排毒時(shí)間較長(zhǎng)，排毒量偏高；細(xì)胞苗A組和細(xì)胞苗B組排毒持續(xù)時(shí)間較短，排毒量較少（見圖8）。

圖8 仔豬排毒情況

4 討論與結(jié)論

PED的防治始于組織滅活苗，但其保護(hù)率較差且難以控制，逐漸被淘汰。馬思奇等使用PEDV的CV777制備的細(xì)胞滅活苗使仔豬獲得較好的免疫保護(hù)率。雖然PEDV只有一個(gè)血清型，但我們通過對(duì)各地分離的毒株進(jìn)行基因序列測(cè)定，證明很多都是變異毒株，與傳統(tǒng)毒株基因差異較大。PEDV毒株的基因變異應(yīng)該是造成免疫失敗和仔豬死亡率高的主要原因。

本項(xiàng)目利用無血清細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)和去除蛋白技術(shù)、生物反應(yīng)器微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)代替轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及先進(jìn)的片狀載體培養(yǎng)工藝進(jìn)行PEDV細(xì)胞滅活苗的制備，解決了生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價(jià)低的問題。通過生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)工藝的改變，提高病毒單位培養(yǎng)效價(jià)10～30倍。疫苗的免疫原性、抗原含量等指標(biāo)都達(dá)到國(guó)內(nèi)商品疫苗的水平，抗原含量≥10-7.5TCID50/0.1 mL，高于同類產(chǎn)品。SIgA抗體的水平和均勻度明顯高于國(guó)內(nèi)水平，正如白翠認(rèn)為的仔豬主要通過初乳及奶液獲得母源SIgA。免疫保護(hù)試驗(yàn)證明本項(xiàng)目疫苗對(duì)仔豬具有較好的免疫保護(hù)率。檢測(cè)產(chǎn)后母豬血清及初乳中的抗體的保護(hù)效價(jià)水平，本試驗(yàn)滅活疫苗保護(hù)率明顯高于其他組，確定該滅活疫苗具有高特異性保護(hù)能力。

綜上所述，本項(xiàng)目研發(fā)的豬流行性腹瀉細(xì)胞滅活苗應(yīng)用于不同片區(qū)豬場(chǎng)分離的變異毒株，具有滴度穩(wěn)定和均一、易純化等特點(diǎn)，獲得比市場(chǎng)疫苗較好的免疫保護(hù)效果，能有效減少仔豬死亡率和提高母豬初乳的抗體水平。