賴宗強(qiáng)，吳麗寧，黎淵弘，唐云峽

（廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530007）

目前肝癌治療困難，常規(guī)治療手段進(jìn)入瓶頸，難以取得新突破?，F(xiàn)代研究證實(shí)絞股藍(lán)皂苷（gypenosides，Gyp）具有抗多種腫瘤功效[1]，具有巨大開(kāi)發(fā)潛力。但是絞股藍(lán)用于抗腫瘤時(shí)本身缺乏靶向性，藥物作用效率不高，而且絞股藍(lán)總皂苷口服后很容易被降解代謝[2-3]，因此需要大劑量或頻繁給藥。因此，迫切需要研發(fā)新型靶向藥物制劑提高絞股藍(lán)的抑癌效果，同時(shí)改善其吸收代謝，才有利于絞股藍(lán)的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。中藥納米載藥制劑可提高藥物的生物利用度[4]，提高藥物的穩(wěn)定性，還可以通過(guò)修飾原件增強(qiáng)中藥的靶向性[5]。脂質(zhì)體是應(yīng)用最多的中藥納米制劑載體之一，其具有優(yōu)良的生物相容性、生物安全性，易通過(guò)各種修飾實(shí)現(xiàn)靶向性等特點(diǎn)[6-7]。適配體（aptamer，Apt）是一類(lèi)經(jīng)篩選得到的單鏈DNA或RNA，可通過(guò)三維結(jié)構(gòu)以高親和力特異性結(jié)合在靶標(biāo)上，具有分子量小、易于修飾合成、低毒低、低免疫原性、組織滲透性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。因此，Apt被廣泛應(yīng)用于藥物靶向治療及腫瘤檢測(cè)等領(lǐng)域[8-10]。用Apt修飾中藥載藥系統(tǒng)的研究鮮有報(bào)道。因此本研究基于Gyp的抗肝癌作用，結(jié)合脂質(zhì)體載藥的優(yōu)良特性，連接能夠靶向腫瘤標(biāo)志物Ep-CAM的Apt（SYL3C）[11]，制備中藥納米載藥系統(tǒng)SYL3C-Gyp@Lipo，并檢測(cè)其表征特性、藥物釋放度及對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向殺傷功能。

1 材料與方法

1.1主要材料

鞘磷脂（SM）、膽固醇（Chol）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）、DSPEPEG（2000）-MAL均購(gòu)自Avanti polar lipids公司（USA）。Gyp購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DMSO試劑、MTT試劑盒購(gòu)自博士德公司，枸櫞酸鈉緩沖液、香草醛、Cy 5.5熒光染料、魚(yú)精蛋白、Triton X-100均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，聚碳酸酯膜購(gòu)自密理博中國(guó)有限公司，其余試劑均為分析純級(jí)別。Apt由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列為：5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-（T）5-SH-3’。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Sorvall Biofuge Stratos型高速離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司），Alpha1-4 LSC型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Martin Christ公司），L-117小型噴霧干燥器（北京來(lái)亨儀器設(shè)備有限公司），TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），Nano-S型激光粒度分析儀（英國(guó)Malvern公司），H-7650型透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Apt功能化的Gyp靶向脂質(zhì)體的制備 將溶解在氯仿中的SM、Chol、DSPE-PEG2000和DSPEPEG（2000）-MAL按摩爾質(zhì)量比55∶40∶4.7∶0.3加入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃蒸發(fā)10 min，形成干燥薄膜，真空干燥儀干燥過(guò)夜以去除殘留的有機(jī)溶劑。將瓶底的脂質(zhì)薄膜用l mL 300 nmol的枸櫞酸緩沖液（pH=4.0）進(jìn)行水化，50℃水浴超聲20 min后，在液氮、60℃水浴反復(fù)凍融5次。將產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器，依次通過(guò)200 nm、100 nm的聚碳酸酯膜各20次，形成直徑在100 nm左右的空白脂質(zhì)體Lipo。按照藥物∶脂質(zhì)體比1∶10，取適量空白脂質(zhì)體和Gyp PBS溶液（1 mg/mL），45℃恒溫振搖90 min，冰浴條件下探頭超聲10 min（超聲時(shí)間2 s，間隔時(shí)間2 s，功率為100 W），即制備包裹Gyp的脂質(zhì)體Gyp@Lipo，透析除去游離的Gyp。取包藥脂質(zhì)體Gyp@Lipo 10 mg，加入2 nmol的SYL3C Apt，氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下室溫反應(yīng)24 h。加入2 nmol的β-半胱胺除去未反應(yīng)的MAL基團(tuán)。透析除去多余的β-半胱胺和SYL3C，即得靶向藥物傳遞系統(tǒng)SYL3CGyp@Lipo，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。為了進(jìn)行熒光表征，制備熒光脂質(zhì)體，即在上述加入絞股藍(lán)步驟中額外加入占總脂質(zhì)體質(zhì)量0.5%的Cy 5.5紅色熒光染料，可得到帶紅色熒光的脂質(zhì)體：Gyp@Lipo-Cy5.5和SYL3C-Gyp@Lipo-Cy5.5。

1.3.2 Gyp定量分析方法的建立[12] Gyp對(duì)照品和空白脂質(zhì)體用5%香草醛冰醋酸溶液—高氯酸（2∶8）混合液顯色，在400～1 100 nm處進(jìn)行光譜掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)為555 nm，且該處空白脂質(zhì)體無(wú)干擾，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為555 nm。然后建立定量分析Gyp的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即精密稱(chēng)取Gyp對(duì)照品，加水配置成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。分別取對(duì)照品溶液1 mL置于15 mL具塞試管中，精密加入混合液2 mL，搖勻，密塞，置60℃水浴中加熱15 min，取出，立即放入冰水中冷卻2 min，精密加入冰醋酸10 mL，搖勻，以試劑作空白，分光光度法于（555±5）nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。以A值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3包封率測(cè)定 采用魚(yú)精蛋白沉淀法進(jìn)行測(cè)定。吸取2 mL SYL3C-Gyp@Lipo，添加0.5 mL魚(yú)精蛋白（10 mg/mL）混勻，接著加入3 mL生理鹽水并靜置5 min，然后離心30 min（3 000 r/min）。收集沉淀，加入10%曲拉通-X100溶解，用生理鹽水定容，然后取溶液測(cè)定Gyp含量，即得到包封的藥物量。

1.3.4載藥脂質(zhì)體的表征 使用Zetasizer分析儀（Nano S）動(dòng)態(tài)光散射法（Dynamic light scattering，DLS）對(duì)樣品粒徑和電位大小進(jìn)行測(cè)量；通過(guò)透射電子顯微鏡H-7650觀察拍攝樣品的形態(tài)。

1.3.5釋放度考察 使用離心方法進(jìn)行體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)，即將10 mg SYL3C-Gyp@Lipo在37℃下溶于10 mL pH 5.4或pH 7.4的PBS緩沖液中，以100 r/min搖動(dòng)。在預(yù)定的時(shí)間間隔，將樣品以5 000 r/min離心10 min，收集上清，通過(guò)前述分光光度法測(cè)定上清液中的Gyp含量，計(jì)算釋放率。

1.3.6靶向性檢測(cè) 為研究載藥脂質(zhì)體與HepG2細(xì)胞的靶向結(jié)合能力，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和HL-7702細(xì)胞（人肝正常細(xì)胞），用50μL PBS重懸細(xì)胞。加入45μL PBS、10μL胎牛血清（FBS）和各組材料（Gyp@Lipo-Cy5.5和SYL3C-Gyp@Lipo-Cy5.5，濃度為500μg/mL）混勻，加入細(xì)胞混懸液，混勻，于4℃下避光孵育30 min，然后PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min。重復(fù)洗滌細(xì)胞3次并重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光脂質(zhì)體與細(xì)胞的結(jié)合率。

1.3.7藥物傳遞系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性考察

使用MTT法測(cè)定藥物體外細(xì)胞毒性。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和HL-7702細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)，細(xì)胞數(shù)控制在1.5×104個(gè)/孔。隨后加入藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)，根據(jù)加入藥物不同，設(shè)置分組為：Gyp組（加入Gyp）、Gyp@Lipo組（加入Gyp@Lipo脂質(zhì)體）、SYL3C-Gyp@Lipo組（加入SYL3C-Gyp@Lipo脂質(zhì)體）；每組設(shè)置不同給藥濃度（脂質(zhì)體中Gyp含量濃度），設(shè)置4個(gè)給藥濃度為：100 μg/mL、300 μg/mL、600 μg/mL、900 μg/mL。分組給藥后，將細(xì)胞在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。孵育結(jié)束后，每孔細(xì)胞分別加入20μL MTT，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中30 min；1 500 r/min離心10 min，棄去上清，每孔加入200μL DMSO，避光振蕩10 min，之后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的OD值。為了進(jìn)一步驗(yàn)證脂質(zhì)體的靶向殺傷性能，本研究設(shè)計(jì)了封閉實(shí)驗(yàn)，設(shè)置SYL3C封閉組，即先將HepG2細(xì)胞與過(guò)量Apt SYL3C先孵育2 h，PBS洗滌后再加入SYL3C-Gyp@Lipo進(jìn)行共培養(yǎng)24 h；還設(shè)置分組：Free SYL3C組，即單純Apt SYL3C與細(xì)胞共孵育24 h；SYL3C-Gyp@Lipo組，即脂質(zhì)體SYL3C-Gyp@Lipo與細(xì)胞共孵育24 h。孵育結(jié)束后各組按前述步驟進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1靶向載藥脂質(zhì)體的表征

通過(guò)分光光度法建立Gyp定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度（A）值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=0.317 9 C+0.088 49，r=0.993 4，由此可計(jì)算出載藥脂質(zhì)體的Gyp包封率為63.87%。

通過(guò)TEM（圖1A）可以看到，制備的載藥納米粒子SYL3C-Gyp@Lipo分散性良好，大小均勻，呈現(xiàn)圓球形或橢圓球形，同時(shí)可以觀察到脂質(zhì)體的雙層膜。表明載藥納米脂質(zhì)體制備成功。各組納米粒子的電位分布和粒徑分布見(jiàn)圖1B和圖1C：空白脂質(zhì)體Lipo的平均水化粒徑為121.23 nm，在包裹Gyp藥物和修飾SYL3C Apt后，平均粒徑分別增大至128.24 nm與133.28 nm?？瞻字|(zhì)體表面電荷為+（12.87±1.24）mV，包裹藥物后降為+（7.53±1.29）mV；SYL3CApt為帶負(fù)電的DNA，故修飾后脂質(zhì)體表面電位進(jìn)一步降至-（10.15±1.35）mV，這也說(shuō)明Apt修飾成功。

圖1 載藥脂質(zhì)體的表征

2.2靶向載藥脂質(zhì)體的體外藥物釋放率

在pH為7.4時(shí)，SYL3C-Gyp@Lipo載藥脂質(zhì)體釋放緩慢，96 h內(nèi)釋放藥物不超過(guò)80%，說(shuō)明與游離藥物相比，脂質(zhì)體制劑呈現(xiàn)出一定的緩釋作用；而為了模擬載藥脂質(zhì)體進(jìn)入腫瘤微酸環(huán)境的釋放，研究設(shè)計(jì)了在pH為5.4時(shí)觀察載藥脂質(zhì)體的釋放情況，可以看到，在pH 5.4的酸性環(huán)境下，SYL3CGyp@Lipo釋藥速度較快，48 h釋放率就已超過(guò)80%，而經(jīng)過(guò)96 h釋放率超過(guò)90%，見(jiàn)圖2。

圖2 SYL3C-Gyp@Lipo在不同pH值（pH 7.4、pH 5.4）環(huán)境96 h內(nèi)藥物累積釋放曲線圖

2.3靶向載藥脂質(zhì)體的體外靶向?qū)嶒?yàn)

為了確定靶向載藥脂質(zhì)體的體外腫瘤靶向能力，使用流式細(xì)胞術(shù)分析比較SYL3C-Gyp@Lipo的細(xì)胞結(jié)合效率（圖3）。結(jié)果可以看到非靶細(xì)胞HL-7702對(duì)SYL3C-Gyp@Lipo沒(méi)有特異性結(jié)合（圖3B），而靶細(xì)胞HepG2細(xì)胞與SYL3C-Gyp@Lipo的結(jié)合率明顯較高（圖3A）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)載藥脂質(zhì)體SYL3C-Gyp@Lipo的體外靶向性能

2.4靶向載藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷性

當(dāng)脂質(zhì)體與HL-7702細(xì)胞共孵育時(shí)（圖4A），在相同Gyp藥物濃度下，SYL3C-Gyp@Lip組與Gyp@Lipo組的細(xì)胞活力無(wú)明顯差異（P＞0.05）；然而與HepG2細(xì)胞共孵育（圖4B），當(dāng)Gyp含量濃度大于300μg/mL，SYL3C-Gyp@Lipo比Gyp@Lipo具有更明顯的細(xì)胞殺傷能力（P＜0.05），且呈劑量依賴性，但是其毒性也略低于游離Gyp（P＜0.05）。通過(guò)靶向脂質(zhì)體SYL3C-Gyp@Lipo對(duì)不同細(xì)胞的殺傷效果差異進(jìn)行比較（圖4C），結(jié)果顯示當(dāng)給藥濃度Gyp含量大于300μg/mL，SYL3C-Gyp@Lipo對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷能力強(qiáng)于HL-7702細(xì)胞（P＜0.05）。

圖4 靶向載藥脂質(zhì)體的體外細(xì)胞毒性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證脂質(zhì)體的靶向殺傷性能，本研究設(shè)計(jì)了封閉實(shí)驗(yàn)，從結(jié)果中可以看出（圖5），游離Apt SYL3C對(duì)HepG2細(xì)胞活力幾乎無(wú)影響，細(xì)胞活力保持在90%左右；而封閉組和SYL3C-Gyp@Lipo組對(duì)細(xì)胞均有抑制作用，但SYL3C-Gyp@Lipo組對(duì)細(xì)胞的殺傷效果更好，該組細(xì)胞活力更低（P＜0.05）。

圖5 載藥脂質(zhì)體的特異靶向殺傷腫瘤細(xì)胞功能驗(yàn)證

3 討論

Gyp通過(guò)多靶點(diǎn)多途徑發(fā)揮抗癌功效，但是經(jīng)口服用途徑很容易被降解，因此需要大劑量或頻繁給藥。而將Gyp制備成載藥脂質(zhì)體后，在胃腸道中能夠受到保護(hù)，避免被快速代謝，可減少每次給藥劑量；另外脂質(zhì)體還有緩釋功能，能減少給藥頻率。但是Gyp脂質(zhì)體制劑的靶向性、藥物傳遞效率有待提高。因此本研究選用能特異性靶向腫瘤標(biāo)志物的Apt SYL3C，用Apt修飾Gyp脂質(zhì)體（Gyp@Li-po），構(gòu)建一個(gè)可保護(hù)藥物且具有緩釋功能的靶向藥物傳遞系統(tǒng)（SYL3C-Gyp@Lipo）。

本研究通過(guò)薄膜分散法制備的脂質(zhì)體，制備過(guò)程中添加了PEG2000，PEG2000不僅增加了納米脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，而且由于PEG層的存在，可在脂質(zhì)體膜內(nèi)、外形成空間位阻，從而阻礙水分子及藥物分子跨膜流動(dòng)[13]，不僅起到保護(hù)藥物作用，避免其在胃腸道快速降解，還使得載藥脂質(zhì)體在96 h內(nèi)呈現(xiàn)出一定地緩釋作用，延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間及藥物在腫瘤局部的暴露時(shí)間。腫瘤細(xì)胞內(nèi)為微酸性環(huán)境，所以本研究探索了pH為5.4的酸性環(huán)境下藥物的釋放情況，結(jié)果顯示48 h釋放率80%以上，96 h釋放了90%以上。在酸性環(huán)境下藥物的快速釋放，可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境下脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的裂解而造成的。已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞的脂質(zhì)體裂解釋放的大量藥物，可以迅速發(fā)揮作用，抑制細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。

上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）可作為多種腫瘤的診斷標(biāo)志和治療靶標(biāo)，在本研究中，靶向EpCAM的SYL3C Apt的修飾賦予了納米脂質(zhì)體的腫瘤識(shí)別性能，增強(qiáng)了藥物的主動(dòng)靶向傳遞。對(duì)比表達(dá)EpCAM的肝癌細(xì)胞HepG2和不表達(dá)EpCAM的正常肝細(xì)胞HL-7702，由于SYL3C Apt的修飾，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)SYL3CGyp@Lipo的識(shí)別，因此HepG2對(duì)載藥脂質(zhì)體SYL3C-Gyp@Lipo的攝取更多；MTT實(shí)驗(yàn)也提示SYL3C-Gyp@Lipo能特異性殺傷HepG2腫瘤細(xì)胞。為進(jìn)一步證實(shí)脂質(zhì)體的靶向殺傷性能，用Apt YL3C封閉結(jié)合位點(diǎn)后再與SYL3C-Gyp@Lipo共培養(yǎng)，載藥脂質(zhì)體的細(xì)胞殺傷性能明顯降低，也再次表明SYL3C-Gyp@Lipo對(duì)腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向殺傷性能，使得SYL3C-Gyp@Lipo特異性地作用于腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。而且，由于EpCAM在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)，在理論上SYL3CGyp@Lipo也能夠靶向其他的腫瘤細(xì)胞，起到廣泛的腫瘤特異性殺傷作用。

本研究制備了一個(gè)具有高效載藥的Apt功能化的Gyp靶向脂質(zhì)體納米藥物傳遞系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)由于Apt能夠特異性的識(shí)別并結(jié)合腫瘤特異位點(diǎn)，以及由于脂質(zhì)體對(duì)藥物的緩釋等優(yōu)良性能，使得納米藥物傳遞系統(tǒng)能夠富集腫瘤部位并對(duì)其持續(xù)殺傷。此外，通過(guò)選擇合適的不同的Apt，理論上它可以靶向任何類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤的靶向治療具有巨大潛力。因此，也為絞股藍(lán)乃至中藥制劑的研究和應(yīng)用提供了新思路。