羅承長(zhǎng)，蘇琪盛，黎小紅，楊 崢，莫武寧

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021）

鼻咽癌（NPC）是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一[1]。在全球范圍內(nèi)，每年確診的NPC患者約有8.7萬(wàn)例[2]。中國(guó)是NPC發(fā)病率和病死率較高的國(guó)家之一[3]。由于NPC發(fā)病部位隱匿，早期癥狀不明顯，超過50%的患者就診時(shí)已處于中晚期，預(yù)后較差[4]。因此，尋找有效基因靶點(diǎn)對(duì)NPC的臨床診斷及治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子2樣1（SDF2L1）在胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌中發(fā)揮重要作用[5-7]。本課題組前期研究顯示，SDF2L1在NPC細(xì)胞中呈低表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)[8]。然而，SDF2L1在NPC中的具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究采用非標(biāo)記蛋白質(zhì)定量（LFQ）分析技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)受SDF2L1調(diào)控的下游關(guān)鍵基因，探究SDF2L1在影響NPC細(xì)胞生物學(xué)功能的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)NPC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、研發(fā)新治療靶點(diǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 本課題組前期已經(jīng)在5-8F細(xì)胞系的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)SDF2L1的NPC細(xì)胞系（5-8Fg）和空載細(xì)胞系（5-8F1）[8]。胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco）；磷酸鹽緩沖液（PBS）和青—鏈霉素混合液（大連美侖生物）；尿素、二硫蘇糖醇（DTT）、羧基氨基甲烷（Tris）、碘乙酰胺（IAA）、甲酸（美國(guó)Sigma）；SDS和RNA引物（上海生工）；胰蛋白酶（北京華利世）；質(zhì)譜級(jí)乙腈、熒光抗體（美國(guó)Thermo）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、蛋白酶抑制劑（南京碧云天）；Trizol試劑（日本TaKa-Ra）；All-In-One 5X RT Master Mix和EvaGreen 2X qPCR Master Mix試劑盒（美國(guó)Applied Biological Materials）；核糖體蛋白L14（RPL14）抗體、GAPDH抗體（英國(guó)Abcam）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS和1%青—鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5-8Fg和5-8F1細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3蛋白的提取 待細(xì)胞長(zhǎng)至90%匯合后使用適量PBS緩沖液清洗，加入0.5 mL SDS裂解液裂解，收集至EP管中。在3個(gè)不同時(shí)期分別收集生長(zhǎng)良好的5-8Fg和5-8F1細(xì)胞各3個(gè)樣品以達(dá)到重復(fù)3次試驗(yàn)的目的。分別向同一時(shí)期5-8Fg和5-8F1樣品中加入0.5 mL Lysis緩沖液[8 mol/L尿素+100 mmol/L Tris-HCl（pH=7.6）+蛋白酶抑制劑]，冰浴超聲15 min，12 000 r/min離心15 min，取上清，使用BCA法進(jìn)行定量。每個(gè)樣品分別取20μg混合pool用于建庫(kù)。

1.4蛋白質(zhì)酶切 取蛋白樣品100μg，每組蛋白樣品按適當(dāng)?shù)捏w積比加入DTT使其終濃度為0.05 mol/L，56℃孵育40 min，用8倍體積的尿素緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行稀釋；在超濾管中加入稀釋后的蛋白樣品，離心；加入200μL尿素緩沖液，離心；加入100μL含50 mmol/L IAA的尿素緩沖液，避光孵育20 min，離心；加入100μL尿素緩沖液，混勻，離心10 min，重復(fù)該步驟兩次；加入100μL 50 mmol/L ABC，離心，重復(fù)該步驟兩次；加入80μL含有50 mmol/L胰酶的ABC（胰酶與蛋白比例為1∶50～1∶100），振蕩1 min；將超濾管放入37℃的水浴鍋酶解16～18 h，轉(zhuǎn)移到新的收集管中，離心，收集；再在超濾管中加入50μL ABC，離心，收集。用nano-drop蛋白濃度檢測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定。

1.5液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜 將所有樣品依次進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。樣品經(jīng)LC系統(tǒng)進(jìn)樣，色譜柱分離，從LC流出的被分離組分通過接口進(jìn)入離子源，組分經(jīng)過離子化后，第一級(jí)質(zhì)量分析器會(huì)根據(jù)質(zhì)荷比將組分分離，最后串聯(lián)進(jìn)入第二級(jí)質(zhì)量分析器進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，獲得質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)。

1.6質(zhì)譜結(jié)果定量分析將LC-MS/MS原始文件導(dǎo)入MaxQuant軟件1.5.2.8進(jìn)行查庫(kù)，根據(jù)搜索引擎-Andromeda進(jìn)行LFQ分析。MaxQuant軟件根據(jù)每次分析中每個(gè)肽段的同位素峰整合LFQ算法，利用所有分析中共有肽段比率的中值來(lái)計(jì)算蛋白比率，將得出的結(jié)果與uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，利用反庫(kù)來(lái)計(jì)算每個(gè)肽段和蛋白質(zhì)的假陽(yáng)性率（FDR）。應(yīng)用meta X軟件作定量值歸一化，缺失值補(bǔ)全，蛋白定量值計(jì)算和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析，最終按照|差異倍數(shù)（FC）|≥1.5且P＜0.05篩選DEPs。

1.7蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI，并由Cytoscape軟件3.7.2進(jìn)行可視化。

1.8差異蛋白的功能富集分析 應(yīng)用R軟件中的“clusterProfiler”包對(duì)DEPs進(jìn)行GO功能注釋及KEGG信號(hào)通路富集分析，調(diào)整P＜0.05視為顯著富集。

1.9受SDF2L1調(diào)控的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的篩選 通過Cytoscape軟件中的MCODE及Cytohubba插件篩選受SDF2L1調(diào)控的關(guān)鍵基因。這兩種方法獲得的交叉基因被認(rèn)為是關(guān)鍵基因。Cytohubba是根據(jù)節(jié)點(diǎn)的中心度來(lái)篩選基因，包括點(diǎn)度中心性（Degree）及接近中心性（Closeness）。

1.10受SDF2L1調(diào)控的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的驗(yàn)證Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org/）囊括了31例NPC患者及10例正常人的基因表達(dá)情況。關(guān)鍵表達(dá)蛋白質(zhì)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)為|FC|≥1.2、P＜0.05且處于差異蛋白的前15%。

1.11實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)RPL14基因表達(dá)用Trizol試劑從組織和細(xì)胞中提取總RNA，使用All-In-One 5X RT MasterMix合成cDNA，按照EvaGreen 2X qPCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：RPL14上游：5’-TTAAGAGCTTCAA-AGGCAGC-3’，下游：5’-TTTTGACCCTTCTGAGCTTTG-3’；GAPDH上游：5’-TGGGTGGACCATGAAG-3’，下游：5’-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGA-3’。用2-△△CT法計(jì)算RPL14基因相對(duì)表達(dá)量。

1.12 Western blotting法檢測(cè)RPL14蛋白表達(dá)

使用90%RIPA裂解緩沖液和10%蛋白酶抑制劑的混合物提取蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白（120 V、1 h），將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜（150 mA、90 min）；加入一抗RPL14（1∶700）、GAPDH（1∶1 400）4℃下孵育過夜，洗膜；加入熒光二抗（1∶10 000）室溫下孵育1 h，洗膜后用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以RPL14蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為RPL14蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件和R 3.6.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用Student-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEPs的鑒定結(jié)果 通過LFQ和串聯(lián)質(zhì)譜分析，共鑒定出4 969個(gè)DEPs，見表1。

表1 蛋白鑒定統(tǒng)計(jì)表

2.2差異表達(dá)蛋白（DEPs）的定量篩選 根據(jù)|FC|≥1.5和P＜0.05，共定量出730個(gè)DEPs，其中表達(dá)下調(diào)的有434個(gè)，表達(dá)上調(diào)的有296個(gè)。DEPs繪制的火山圖和熱圖如圖1所示。

圖1 蛋白質(zhì)質(zhì)譜的定量分析結(jié)果

2.3 GO和KEGG富集分析GO富集分析到112條細(xì)胞組分（CC）、20條分子功能（MF）和225條生物學(xué)過程（BP）。DEPs主要定位于核糖體和胞質(zhì)，發(fā)揮核糖體構(gòu)成、黏附蛋白結(jié)合等分子功能，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白靶向、病毒轉(zhuǎn)錄及基因表達(dá)、蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位等生物學(xué)過程，見圖2A～C。KEGG富集分析顯示，DEPs顯著富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、核糖體構(gòu)成、氨基酸生物合成及內(nèi)吞作用等22條信號(hào)通路，見圖2D。

圖2 DEPs顯著富集的前30個(gè)GO條目和前10個(gè)KEGG信號(hào)通路

2.4關(guān)鍵DEPs的篩選將STRING網(wǎng)站構(gòu)建的PPI導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析。通過Cytohubba插件中的接近中心性得到Closeness的值，根據(jù)點(diǎn)度中心性得到蛋白質(zhì)的Degree值，分?jǐn)?shù)最高的前50個(gè)蛋白質(zhì)視為關(guān)鍵蛋白質(zhì)。此外，通過MCODE插件得到不同的子網(wǎng)絡(luò)，其中模塊1得分最高。因此，模塊1內(nèi)的53個(gè)蛋白質(zhì)視為關(guān)鍵蛋白質(zhì)（圖3A）。最后，真正的關(guān)鍵蛋白質(zhì)認(rèn)定為Cytohubba和MCODE插件獲得的31個(gè)交叉蛋白質(zhì)（圖3B）。

圖3 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵DEPs的篩選

2.5關(guān)鍵DEPs的驗(yàn)證 通過Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的31個(gè)關(guān)鍵DEPs進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到受SDF2L1調(diào)控并且在NPC細(xì)胞中顯著上調(diào)的蛋白有RPL6、RPS15A、SEC61A1、RPL24、RPL37A，顯著下調(diào)的蛋白為RPL14，見表2。

表2 SDF2L1下游關(guān)鍵調(diào)控蛋白在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的驗(yàn)證

2.6 RPL14作為SDF2L1下游關(guān)鍵調(diào)控蛋白的驗(yàn)證RT-qPCR和Western blotting結(jié)果顯示：5-8Fg細(xì)胞中RPL14 mRNA和蛋白表達(dá)量均低于5-8F1細(xì)胞，見圖4。

圖4 RPL14在NPC細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

SDF2L1是一個(gè)潛在的抑癌因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[9]。Willis等[5]通過meta分析發(fā)現(xiàn)，卵巢漿液性癌患者SDF2L1低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。同樣地，Kang等[6]發(fā)現(xiàn)，SDF2L1在乳腺癌中亦呈低表達(dá)，其表達(dá)量與患者腫瘤惡化及預(yù)后呈正比。張靖承[7]發(fā)現(xiàn)，SDF2L1在胰腺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)差異性，當(dāng)敲低SDF2L1時(shí)，胰腺癌細(xì)胞增殖受到抑制，且癌細(xì)胞對(duì)化療藥物（吉西他濱）的敏感性提高，提示SDF2L1是一種潛在的胰腺癌化療耐藥治療靶點(diǎn)。研究表明，在NPC組織和細(xì)胞中，SDF2L1顯著表達(dá)下調(diào)；當(dāng)SDF2L1表達(dá)沉默時(shí)可以促進(jìn)NPC的增殖、遷移和體外侵襲，而過表達(dá)SDF2L1則起到相反作用[8]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析在發(fā)現(xiàn)癌癥關(guān)鍵基因，了解癌癥發(fā)展機(jī)制及癌癥預(yù)防、診斷和治療中具有重要的臨床意義[10]。為了深入了解SDF2L1在NPC中的作用，本組首次運(yùn)用LFQ技術(shù)在NPC細(xì)胞中鑒定了受SDF2L1調(diào)控的下游關(guān)鍵蛋白質(zhì)，共得到730個(gè)DEPs。GO和KEGG富集分析揭示DEPs主要發(fā)揮核糖體構(gòu)成、細(xì)胞黏附中的鈣粘蛋白結(jié)合等分子功能，參與了病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過程，同時(shí)還涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、核糖體、RNA運(yùn)輸?shù)刃盘?hào)通路。結(jié)合多種生物信息學(xué)分析得到9個(gè)受SDF2L1調(diào)控的下游蛋白，分別為RPL6、RPS15A、SEC61A1、RPL24、RPL37A、RPL31、ISG15、RPN2和RPL14，其中只有RPL14下調(diào)。蛋白組學(xué)的結(jié)果提示，核糖體蛋白質(zhì)在NPC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中可能扮演重要的角色，SDF2L1可能在核糖體調(diào)控DNA的修復(fù)和凋亡中發(fā)揮重要作用。

核糖體蛋白在腫瘤的早期診斷、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面具有重要作用[11-12]。RPL14基因是核糖體蛋白L14E家族的成員，有一個(gè)高度多態(tài)的三核苷酸重復(fù)序列，在丙氨酸殘基延伸中發(fā)揮重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，RPL14在多種癌癥（包括肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、惡性卵巢生殖細(xì)胞瘤等）中作為抑癌因子存在[14-17]。一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，RPL14下調(diào)與乳腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)，并且在臨床患者組織中驗(yàn)證了RPL14的差異性表達(dá)[18]。此外，RPL14能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。同時(shí)，Sun等[20]體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)RPL14的表達(dá)可以解除miR-129-5p對(duì)宮頸癌的促進(jìn)作用，提示RPL14在癌癥中作為促癌因子存在。以上文獻(xiàn)表明，RPL14在不同的癌癥中可能扮演著不同角色。本研究結(jié)果顯示，RPL14在SDF2L1過表達(dá)的NPC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，結(jié)果與蛋白組學(xué)一致，這提示SDF2L1可能通過下調(diào)RPL14的表達(dá)，從而抑制NPC的進(jìn)展，在NPC中RPL14可能發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)LFQ和生物信息學(xué)分析，共獲得RPL6、RPS15A、SEC61A1、RPL14、RPL31、RPL37A、ISG15等9個(gè)受SDF2L1調(diào)控的關(guān)鍵下游蛋白，均可能在NPC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。SDF2L1可能通過抑制RPL14表達(dá)影響NPC細(xì)胞的生物學(xué)行為，但確切的分子機(jī)制仍需深入研究。下一步本組將以RPL14為靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白交互作用實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索NPC中受RPL14直接調(diào)控的下游基因，為今后闡明NPC的發(fā)病機(jī)制提供更為直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。