白先愚，郭興喆，成南南，楊萌哲，周守常，覃柳潔，黃元姣，林文珍,2△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，南寧 530021；2.廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院，南寧 530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)最常見(jiàn)的頭頸惡性腫瘤，也是我國(guó)南部地區(qū)最典型的惡性腫瘤中的一種[1]。在廣西，NPC是排名在第4位的惡性腫瘤，發(fā)病人群越來(lái)越年輕化，對(duì)于局部進(jìn)展期NPC患者，傳統(tǒng)治療是以順鉑為基礎(chǔ)的同步放、化療，其局部控制率高達(dá)80%以上[2]，但由于大部分患者就診時(shí)就處于中、晚期，患者整體預(yù)后很差[3]，放療后還會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，且放、化療常有殺傷正常細(xì)胞等反應(yīng)及較嚴(yán)重的并發(fā)癥[4]。所以，尋求對(duì)NPC有良好效果且副作用較小的治療藥物迫在眉睫。

蝙蝠葛（別名北豆根）為防己科植物，性味苦寒，其根、莖、葉及果實(shí)均有藥用價(jià)值。蝙蝠葛堿（Dauricine）是從蝙蝠葛的根莖中分離提取而得到的一種中藥單體。研究表明，蝙蝠葛堿對(duì)NPC CNE-1細(xì)胞及CNE-2Z細(xì)胞[5]以及HL60、K562等腫瘤相關(guān)細(xì)胞具有顯著抑制作用[6-7]，但其對(duì)NPC的作用機(jī)制尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)蝙蝠葛堿對(duì)NPC的潛在靶點(diǎn)及相關(guān)通路信息,并用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以尋證防治NPC的新靶點(diǎn)及有效防治藥物，為蝙蝠葛藥材的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物和試劑

人NPC CNE2細(xì)胞系購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，NPC CNE2細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含1%青—鏈霉素混合液、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)至80%時(shí)，用0.25%含EDTA的胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。蝙蝠葛堿（貨號(hào)：DB0023），成都德斯特生物科技有限公司。PI3K小鼠單克隆抗體（貨號(hào)：67071-1-Ig）、AKT小鼠單克隆抗體（貨號(hào)：60203-2-Ig），美國(guó)Proteintech公司；BCA法蛋白含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：P0010），上海碧云天生物科技有限公司；熒光小鼠二抗（貨號(hào)：SA5-35521），美國(guó)Invitrogen公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒10%（貨號(hào)：PG112），上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司。CCK-8試劑盒（貨號(hào)：CK04），上海東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8檢測(cè)蝙蝠葛堿對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2細(xì)胞，用0.25%含EDTA的胰酶進(jìn)行消化處理，重懸為單細(xì)胞懸液，以5 000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁12 h，小心地吸出培養(yǎng)液，分別加入含蝙蝠葛堿的培養(yǎng)基100μL，濃度梯度為5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L（最高濃度的DMSO含量為0.05%），對(duì)照組加入相同體積含0.05%DMSO的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，吸出含蝙蝠葛堿的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，按照CCK-8使用說(shuō)明書，每孔加入100μL RPMI-1640培養(yǎng)基和10μL CCK-8，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育90 min。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度（A），計(jì)算不同濃度蝙蝠葛堿對(duì)細(xì)胞的抑制率并繪制細(xì)胞增殖的抑制率曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%，As：實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、毒性物質(zhì)），Ac：對(duì)照孔（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有毒性物質(zhì)），Ab：空白孔（不含細(xì)胞和毒性物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8）。

1.2.2化合物及NPC靶點(diǎn)的查詢及篩選在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索Dauricine 3D結(jié)構(gòu)，并將其3D結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入到Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)中（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）篩選得到蝙蝠葛堿靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/）搜索NPC靶點(diǎn)。通過(guò)venn在線平臺(tái)（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）對(duì)藥物和疾病靶點(diǎn)取交集。

1.2.3蝙蝠葛堿與NPC靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）的網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建及分析String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）是一個(gè)搜尋蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，其旨在提供PPI的評(píng)估和集成。將通過(guò)維恩取交集得到的基因輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)輸入Cyto-scape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化。軟件中的Network Analysis plugin對(duì)可視化圖中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并根據(jù)度值的大小而區(qū)分節(jié)點(diǎn)的生物功能。

1.2.4 GO功能和KEGG pathway通路富集及化合物—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

David數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）是一套完整的功能注釋在線工具，供研究者理解大量基因背后的生物學(xué)意義。將藥物與NPC靶點(diǎn)交集輸入David數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG、GO功能注釋分析。制作靶點(diǎn)—通路—藥物之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“蝙蝠葛堿—NPC疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)靶蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-2細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL接種于6孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24 h，藥物分組處理細(xì)胞結(jié)束后，收集細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次，收集細(xì)胞后，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，混勻，超聲破壞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)；超聲后的細(xì)胞用4℃低溫離心機(jī)以12 000 r/min離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液按5∶1比例稀釋并混合后 煮沸5 min，SDS-PAGE進(jìn)行150 V恒壓電泳70 min，將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至0.45μm的PVDF膜上（270 mA恒流65 min），5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST清洗3次后分別加入相應(yīng)一抗（1∶1 000），置于4℃冰箱孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次，室溫下加入二抗（1∶20 000）孵育1.5 h，TBST清洗3次后進(jìn)行ECL顯色。用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算和分析目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蝙蝠葛堿對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，加藥組隨著蝙蝠葛堿濃度的升高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，CNE2細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，作用24 h、48 h、72 h的半抑制濃度（IC50）分別為81.6μmol/L、26.2μmol/L、20.8μmol/L，見(jiàn)圖1。

圖1 蝙蝠葛堿對(duì)CNE2細(xì)胞增殖的影響

2.2 蝙蝠葛堿治療NPC潛在靶標(biāo)預(yù)測(cè)

將蝙蝠葛堿的3D結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出Z>0的靶點(diǎn)，得到118個(gè)靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索NPC靶點(diǎn)1 788個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)venn在線平臺(tái)取交集，得到69個(gè)靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 蝙蝠葛堿與NPC相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 蝙蝠葛堿治療NPC共有基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將69個(gè)交集靶位信息輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),可以得到蝙蝠葛堿—NPC靶點(diǎn)的PPI圖，將其結(jié)果輸入Cytoscage3.7.2程序，可以得到蛋白質(zhì)的相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（圖3）。網(wǎng)絡(luò)中包括了69個(gè)節(jié)點(diǎn)和513條邊，該網(wǎng)絡(luò)布局是根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Degree水平按順時(shí)針?lè)较驈男〉酱筇荻扰判颍G色節(jié)點(diǎn)代表蝙蝠葛堿在NPC中的潛在靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)中間的線表示與不同蛋白質(zhì)間相互作用有關(guān)，光度值最高的前18個(gè)節(jié)點(diǎn)（表1）。其中該網(wǎng)絡(luò)中度值最大的靶位是ALB，度值約為50，其次是AKT1、EGFR、MMP9、SRC、CASP3等，其中度值更多的靶蛋白可能是蝙蝠葛堿防治NPC的重要靶點(diǎn)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 蝙蝠葛堿治療NPC潛在靶點(diǎn)

2.4 KEGG 通路富集分析及化合物—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

用David的KEGG通路富集分析,共得到了75條通道。以P≤0.001為水準(zhǔn),篩選出與NPC相關(guān)的前13條通路（表2）。結(jié)果顯示，在pathways in cancer、PI3K-AKT信號(hào)通路、proteoglycans in cancer和prolactin signaling pathway等通路上富集較多（圖4）。利用蝙蝠葛堿與通道的關(guān)聯(lián),以及通過(guò)藥物與蛋白之間的關(guān)系,來(lái)構(gòu)建“蝙蝠葛堿-靶點(diǎn)-通道”的網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。網(wǎng)絡(luò)共包括91個(gè)節(jié)點(diǎn)和370條邊。

圖4 蝙蝠葛堿KEGG通路富集圖

圖5 蝙蝠葛堿-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

表2 蝙蝠葛堿KEGG高富集通路

2.5 GO功能注釋

將維恩網(wǎng)站交集出的69個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到David數(shù)據(jù)庫(kù)選擇GO功能富集分析，以P≤0.001為水準(zhǔn)，共篩選出140個(gè)與GO富集相關(guān)條目。包含了94條相關(guān)生物進(jìn)程和16條相關(guān)細(xì)胞組成和30條相關(guān)分子功能，按照P值升序排列結(jié)果顯著富集的條目（圖6）。結(jié)果表明，分子功能涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合等；生物過(guò)程包括凋亡過(guò)程涉及細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、蛋白水解、肽基酪氨酸磷酸化等；涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、胞質(zhì)溶膠等與細(xì)胞組成相關(guān)。

圖6 蝙蝠葛堿GO功能注釋

2.6 蝙蝠葛堿對(duì)PI3K及AKT蛋白的影響

用30μmol/L蝙蝠葛堿作用CNE2細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明，PI3K、AKT蛋白表達(dá)量低于空白對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖7 蝙蝠葛堿對(duì)CNE2細(xì)胞PI3K-AKT通路蛋白的影響

3 討論

NPC的臨床化療藥物以鉑類為主，放療為輔，最常用的藥物為順鉑，但其不良反應(yīng)嚴(yán)重降低了患者的生存質(zhì)量及治療依從性[8]，具有一定的局限性。中藥單體是從傳統(tǒng)中藥中分離的單一化合物，因其機(jī)制明確，便于研究，受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。有研究表明，青蒿素可以通過(guò)下調(diào)TGF-β信號(hào)通路抑制乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[9]，紫杉醇是中藥紅豆杉樹(shù)皮的提取物，獲得美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)，可以用于治療乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及卡波濟(jì)氏肉瘤[10]?；谥兴巻误w在腫瘤防治中突出的療效和優(yōu)勢(shì)，尋找有效治療腫瘤的中藥單體，成為目前的研究熱點(diǎn)[11]。

蝙蝠葛堿是從蝙蝠葛的根莖中分離提取而得到的一種中藥單體，課題組前期的CTG實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蝙蝠葛堿處理后的CNE-2細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度低于未處理的CNE-2細(xì)胞的強(qiáng)度，提示蝙蝠葛堿可抑制CNE-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)一步的CCK-8實(shí)驗(yàn)也表明蝙蝠葛堿可抑制CNE-2細(xì)胞的增殖，其48 h的IC50為26.2μmol/L。多數(shù)研究也發(fā)現(xiàn)，蝙蝠葛堿能明顯抑制包括NPC細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖[5,7,12-13]，這些結(jié)果表明，蝙蝠葛堿可抑制NPC細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其作用機(jī)制尚不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為現(xiàn)代藥物研發(fā)提供了一種新的方法，大大節(jié)省了時(shí)間和成本[14]。本研究篩選出能用于治療NPC的69個(gè)潛在靶點(diǎn)。將這69個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ALB、AKT1、EGFR、MMP9、SRC、CASP3、ESR1、HSP90AA1等這些度值較高的靶蛋白可能是蝙蝠葛堿治療NPC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。KEGG通路富集分析表明，與NPC相關(guān)度最高的通路為癌癥信號(hào)（pathways in cancer）、PI3K-AKT信號(hào)、癌癥蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、催乳激素信號(hào)（prolactin signaling pathway）等通路。進(jìn)一步的蝙蝠葛堿-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果顯示，PIK3CG、AKT1、GRBL等度值較高，是蝙蝠葛堿治療NPC的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。這些結(jié)果表明，PI3K-AKT信號(hào)通路是蝙蝠葛堿作用于NPC的關(guān)鍵通路。此外，GO富集分析表明生物過(guò)程和功能主要富集于凋亡過(guò)程、負(fù)調(diào)控調(diào)控、蛋白水解、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)結(jié)合和ATP結(jié)合。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞正常發(fā)育中必不可少的過(guò)程[15]。癌細(xì)胞會(huì)逃避細(xì)胞凋亡并形成腫瘤[16]。蛋白質(zhì)水解是指蛋白質(zhì)在水解酶的催化作用下水解過(guò)程的統(tǒng)稱。這一過(guò)程所形成的水解產(chǎn)物在人體內(nèi)要比自由氨基酸和沒(méi)有水解的蛋白質(zhì)更易于吸收。蛋白水解酶是這一過(guò)程的主要參與部分，有研究表明，一系列的蛋白水解酶在凋亡過(guò)程中起到重要作用[17]。這些結(jié)果提示蝙蝠葛堿可能通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。

PI3K-AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和血管生成等過(guò)程，在非小細(xì)胞肺癌、胃癌和肝癌等多種癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是NPC發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)通路之一。生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素、缺氧等細(xì)胞外信號(hào)刺激可激活PI3K。AKT是PI3K的重要下游分子，兩者相互協(xié)同作用，共同發(fā)揮著促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用。當(dāng)PI3K被激活后,細(xì)胞膜內(nèi)表面的PIP2受到催化，生成PIP3并作為第二信使，激活A(yù)KT。當(dāng)AKT被激活后，線粒體途徑的Bcl-2也被激活，進(jìn)而起主導(dǎo)作用。Bcl-2含有BH4結(jié)構(gòu)域和TM，主要錨定在線粒體外膜，可以在很多細(xì)胞中阻斷細(xì)胞色素C從線粒體中釋放以及防止Caspase凋亡蛋白的激活。Wang等[18]的研究顯示，通過(guò)雷公藤甲素作用于NPC C666-1細(xì)胞后，PI3K和AKT的活性降低，同時(shí)，Bcl-2的表達(dá)減少，Caspase3的活性也降低，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，蝙蝠葛堿可抑制CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能下調(diào)PI3K和AKT蛋白的表達(dá)，表明蝙蝠葛堿對(duì)NPC細(xì)胞中PI3K和AKT蛋白產(chǎn)生了抑制作用,與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的預(yù)測(cè)結(jié)論相符，即蝙蝠葛堿能阻斷PI3K-AKT信號(hào)通路控制NPC細(xì)胞的生長(zhǎng)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，蝙蝠葛堿可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。但蝙蝠葛堿是否通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子實(shí)驗(yàn)等對(duì)蝙蝠葛堿治療NPC進(jìn)行了多維度、多層次的研究和比較分析，發(fā)現(xiàn)蝙蝠葛堿對(duì)NPC的作用靶點(diǎn)及可能的作用機(jī)制，為NPC藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。