于小佳，朱明武，董 航，程 睿，劉思辰，張守亮，姜 峰，張晨光

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 新鄉(xiāng) 453002)

精神分裂癥(schizophrenia，SCZ)是一種慢性疾病，臨床表現(xiàn)為感知、思維、情感和行為障礙等，嚴(yán)重影響患者及其家人的生活質(zhì)量[1]。SCZ與遺傳高度相關(guān)，免疫失調(diào)[2-3]、產(chǎn)前母體病毒感染[4]等因素也會增加SCZ的發(fā)病風(fēng)險。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)和連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)分析發(fā)現(xiàn)，染色體6p21-24區(qū)域的人類主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)包含一些SCZ易感基因，而人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA) 6p21.3位于此區(qū)域，因此HLA被認(rèn)為是SCZ易感的重要候選基因[5-6]。HLA-G是一種非經(jīng)典的MHC-Ⅰb類分子，具有有限的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和組織分布限制性，通常高表達(dá)在妊娠期胚胎的羊水細(xì)胞、母胎界面絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞上；但在病理?xiàng)l件下，HLA-G可與免疫細(xì)胞上的抑制性受體結(jié)合，發(fā)揮免疫耐受作用，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[7-8]。為了深入探究HLA-G基因SNP與SCZ遺傳易感的相關(guān)性，本課題采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和Sanger測序技術(shù)，研究河南漢族SCZ患者HLA-G基因外顯子2、4、8多態(tài)性，以期發(fā)現(xiàn)有臨床意義的多態(tài)性位點(diǎn)，為輔助臨床診治SCZ提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2015年9月至2017年5月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的SCZ患者353例為SCZ組，患者均符合《精神疾病診斷統(tǒng)計手冊(第5版)》關(guān)于SCZ的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。另選擇同期健康體檢者362例作為對照組(均無精神類疾病家族史)。SCZ組：男181例，女172例；年齡15～46(36.82±13.55)歲；對照組：男188例，女174例；年齡18～53(35.01±13.03)歲。2組受試者的年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者或家屬簽署書面知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器外周血基因組提取試劑盒和PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Eppendorf 5810R大容量高速冷凍離心機(jī)購自德國艾本德公司，梯度C1000 Touch PCR儀、PCR擴(kuò)增儀C1000購自美國Bio-Rad公司，Tanon 3500全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司，DYY-6G核酸膠電泳儀購自北京市六一儀器廠。

1.3 HLA-G基因擴(kuò)增及測序方法采集所有受試者EDTA-K2抗凝全血2 mL，按試劑盒說明書提取基因組DNA，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增HLA-G外顯子2、4、8(E2、E4、E8)的基因片段，反應(yīng)體系均為25 μL，包括12.50 μL 2×Pfu PCR Master Mix、0.25 μg DNA，上下游引物(0.40 μmol·L-1)各1.00 μL，用去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25 μL。E2:正向引物序列為5′-GGGTCGGGCGGGGTCTCAA-3′，反向引物序列為5′-TCCGTGGGGGCATGGAGGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度361 bp；E4：正向引物序列為5′-CCATGAGAGATGCAAAGTGCT-3′，反向引物序列為5′-TGCTTTCCCTAACAGACATGAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度364 bp；E8：正向引物序列為5′-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3′，反向引物序列為5′-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度210 bp或224 bp。擴(kuò)增條件為：(1)外顯子E2：預(yù)變性94 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s、64 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸 5 min；(2)外顯子E4：預(yù)變性94 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s、62 ℃退火 30 s、72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸5 min；(3)外顯子E8：預(yù)變性94 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸 5 min。外顯子E2、E4的擴(kuò)增產(chǎn)物由北京金唯智公司進(jìn)行Sanger測序，其測序引物分別為：5′-GGGCATGGAGGGGTGGGGGTCGTGAT-3′和5′-CCATGAGAGATGCAAAGTGCT-3′。外顯子E8有14 bp 插入/缺失(insert/deletion，I/D)多態(tài)性，其擴(kuò)增產(chǎn)物可以直接通過瓊脂糖凝膠電泳分析，無需經(jīng)過測序分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用DNA star V7.0軟件對相應(yīng)的SNPs 位點(diǎn)進(jìn)行分析。使用SHEsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)直接計算HLA-G基因的基因型和等位基因頻率，檢驗(yàn)Hardy-Weinberg(H-W)平衡，并對符合H-W平衡的SNP位點(diǎn)進(jìn)行LD和單倍型分析(D′和r2值)。應(yīng)用SPSS 22.0軟件對多重遺傳模型(加性、顯性、隱性、超顯性、共顯性)進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，通過優(yōu)勢比(odd ratio，OR)值、95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)評估SCZ的遺傳易感風(fēng)險；計數(shù)資料(如基因型、等位基因、單倍型和性別等)以例數(shù)和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-G基因SNP的基因型和等位基因頻率比較結(jié)果見表1和表2。在擴(kuò)增的3個HLA-G片段中，共觀察到7個SNP位點(diǎn)，分別是E2及其側(cè)冀的rs1628628(+188C/T)、rs9258495(+324G/T)、rs41551813(+292A/T)、rs1130355(+372A/G)，E4中的rs12722482(+1799C/T)、rs749449002(+1811A/G)，以及E8中的rs371194629 [14bp (D/I)]。SCZ組和對照組受試者7個HLA-G SNP基因型頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。除rs9258495外，其余6個位點(diǎn)的基因型分布均符合H-W平衡。

表1 SCZ組和對照組受試者HLA-G SNP的基因型頻率比較

表2 SCZ組和對照組受試者HLA-G SNP的等位基因頻率比較

在7個HLA-G SNP位點(diǎn)中，rs1628628、rs1130355和rs371194629的最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)均大于0.05，SCZ組rs1628628(+188C/T)的T等位基因頻率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其余各位點(diǎn)等位基因頻率2組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 不同遺傳模式下HLA-G SNP與SCZ的關(guān)聯(lián)性結(jié)果見表3。將MAF>0.05的rs1628628、rs1130355、rs371194629多態(tài)性位點(diǎn)，以年齡和性別為因變量，在不同遺傳模式下HLA-G SNP與SCZ發(fā)生風(fēng)險進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs1628628(+188C/T)的T等位基因通過加性模型(P=0.023，OR=1.275，95%CI 1.035～1.571)、顯性模型(P=0.024，OR=1.468，95%CI 1.053～2.048)和共顯性模型(P=0.025，OR=1.613，95%CI 1.062～2.451)增加SCZ的發(fā)病風(fēng)險。

表3 不同遺傳模式下HLA-G SNPs與SCZ的易感關(guān)聯(lián)性

2.3 HLA-G基因的LD及單倍型與SCZ的遺傳易感性關(guān)系結(jié)果見圖1和表4。符合H-W平衡的6個HLA-G SNP位點(diǎn)中，rs1628628(+188C/T)和rs1130355(+372A/G)具有相對較強(qiáng)的LD(D′=0.943，r2=0.612)。

注：A:D′;B:r2；方框中的數(shù)值表示百分比，方框中顏色加深表示LD程度加強(qiáng)；A圖中的空框表示D′=1(100%)。

表4 HLA-G單倍型與SCZ的遺傳易感相關(guān)性

HLA-G單倍型與SCZ存在顯著相關(guān)性(χ2=22.790，P=0.012)。SCZ組與對照組受試者單倍型CAGCAI和TAGCAD的分布頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。單倍型TAGCAD顯著增加SCZ的發(fā)病風(fēng)險(P=0.009，OR=8.834，95%CI 1.218～64.064)，單倍型CAGCAI可顯著降低SCZ的發(fā)病風(fēng)險(P=0.002，OR=0.414，95%CI 0.234～0.734)。

3 討論

SCZ是一種具有生物學(xué)異質(zhì)性的神經(jīng)精神疾病，其誘發(fā)因素尚不明確，但是近年來個體的神經(jīng)發(fā)育過程、谷氨酸調(diào)節(jié)和免疫系統(tǒng)差異激活，以及基因變體之間的相互作用、表觀遺傳學(xué)標(biāo)記、基因表達(dá)調(diào)控等復(fù)雜的分子遺傳機(jī)制引起了科研工作者的廣泛關(guān)注，科研工作者普遍認(rèn)為SCZ是由遺傳、生物和環(huán)境等因素相互作用的結(jié)果[2-4,10]。GANGADIN等[2]研究發(fā)現(xiàn)，SCZ的早期階段存在著免疫失調(diào)的跡象，隨著疾病的進(jìn)展，出現(xiàn)白質(zhì)、髓鞘和灰質(zhì)減少等神經(jīng)退行性變。黏膜微生物群可以通過改變?nèi)梭w免疫系統(tǒng)的功能來改變患者的行為和影響認(rèn)知[10]。上述研究充分說明，遺傳因素[5-6]、免疫激活或免疫失調(diào)[2-4,10]等均可導(dǎo)致SCZ的發(fā)病。有研究發(fā)現(xiàn)，感染、自身免疫性疾病和過敏性疾病可增加SCZ的發(fā)病風(fēng)險，免疫系統(tǒng)最重要的HLA區(qū)域與SCZ存在著顯著的遺傳關(guān)聯(lián)性[3-5]。GWAS和LD分析也顯示，HLA區(qū)帶包含一些SCZ易感基因[5-6]。HLA-G是一種非經(jīng)典的HLA-Ⅰb類分子，可以與細(xì)胞表面的特異性抑制性受體結(jié)合，發(fā)揮免疫抑制特性，有效地抑制CD4+T細(xì)胞增殖，抑制自然殺傷細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的殺傷功能，在調(diào)節(jié)機(jī)體固有免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8,11]。HLA-G蛋白在胚胎發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用，其基因SNP變異和異常表達(dá)與先兆子癇、炎癥和自身免疫性疾病相關(guān)，提示HLA-G可通過孕婦產(chǎn)前免疫激活賦予家庭后代SCZ患病風(fēng)險[4,7]。因此，本研究通過PCR和測序技術(shù)檢測了SCZ患者的HLA-G基因部分編碼區(qū)及mRNA的3′端非翻譯區(qū)14 bp多態(tài)性，以期尋找與SCZ關(guān)聯(lián)的HLA-G SNP位點(diǎn)，在所擴(kuò)增的外顯子E2、E4和E8區(qū)段共發(fā)現(xiàn)了7個HLA-G SNP位點(diǎn)，除rs9258495外，其他6個位點(diǎn)均符合H-W平衡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個HLA-G多態(tài)性位點(diǎn)中僅rs1628628與SCZ有關(guān)聯(lián)，其T等位基因頻率明顯高于對照組，提示+188C/T的T等位基因可增加SCZ的易感風(fēng)險，C等位基因?qū)CZ疾病的發(fā)生具有一定的保護(hù)作用，SCZ患者基因型TT在加性、顯性和共顯性遺傳模式中均占優(yōu)勢。由于+188C/T位點(diǎn)位于第1內(nèi)含子區(qū)，不影響HLA-G基因的翻譯和蛋白質(zhì)的表達(dá)，此位點(diǎn)多態(tài)性影響SCZ疾病的臨床價值有限。本研究對6個符合H-W平衡的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了LD估計和單倍型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs1628628(+188C/T)和rs1130355(+372A/G)之間有相對較強(qiáng)的LD，2種單倍型與SCZ顯著相關(guān)，其中單倍型CAGCAI對人群發(fā)生SCZ有保護(hù)作用，單倍型TAGCAD人群易患SCZ。

綜上所述，SCZ患者的+188C/T多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因均與健康人群存在著差異，尤其是T等位基因頻率和包括+188T在內(nèi)的單倍型頻率在SCZ患者中占優(yōu)勢，提示HLA-G的+188C/T與SCZ的易感性有關(guān)。由于+188C/T多態(tài)位點(diǎn)處于非編碼區(qū)，并不影響HLA-G蛋白的表達(dá)，HLA-G蛋白是否免疫調(diào)控SCZ發(fā)病過程，還有待進(jìn)一步探究。后期將增加SCZ患者HLA-G SNP位點(diǎn)的檢測，結(jié)合膜型HLA-G和分泌型HLA-G等指標(biāo)進(jìn)一步評價HLA-G免疫調(diào)節(jié)SCZ病情進(jìn)展過程。