蔡昕原，申文盛，馬 麗，劉向榮，吳 燕，趙順省，楊再文

(1.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710054；2.自然資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710021)

0 引 言

富油煤的焦油產(chǎn)率大于7%，主要賦存于中低階煤類中，是一種寶貴的煤基油氣資源[1-2]。目前主要采用傳統(tǒng)的熱轉(zhuǎn)化方式提取焦油和其他高附加值化學(xué)品，但熱轉(zhuǎn)化技術(shù)因設(shè)備復(fù)雜、能耗高、污染大等原因，未能在工業(yè)上大規(guī)模利用[3-5]。

FAKOUSSA和COHEN認(rèn)為微生物能在煤上生長，并產(chǎn)生黑色液體，這意味著微生物可將煤由固相轉(zhuǎn)化為液相，分離并加工成精細(xì)化學(xué)品和液體燃料等[6-7]。煤的微生物轉(zhuǎn)化過程通常在常溫、常壓下進(jìn)行，條件溫和、能耗低、設(shè)備簡單，被認(rèn)為是煤炭綠色轉(zhuǎn)化的途徑之一[8-13]。但是，微生物對(duì)煤的降解率低限制了其在工業(yè)上的推廣[14-16]。影響煤降解率的因素有煤種、菌種、煤的預(yù)處理方法、降解方式、添加表面活性劑等，其中添加適合的表面活性劑是一種較為有效的方法[17]。YIN等利用表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)改善了菌種對(duì)煤的吸附，提高了撫順褐煤的微生物溶解度[18]。袁紅莉等發(fā)現(xiàn)斜臥青霉P6分泌的生物表面活性劑可以促進(jìn)褐煤的液化[19]。POLMAN和STRANDBERG等研究表明，煤、表面活性劑與菌種的相互作用是微生物增溶的主要原因，表面活性劑不直接溶解煤[20-21]。筆者也進(jìn)行了相關(guān)探索實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)表面活性劑直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)均能提高神木褐煤的微生物降解率，其中Triton X-100的作用效果最好，使降解率提高到61.9%[22]。因此，深入研究表面活性劑在微生物降解煤過程中的促進(jìn)作用，將會(huì)推動(dòng)煤生物降解的工業(yè)化進(jìn)程。

筆者利用金雀兒根瘤蒼白桿菌降解陜北富油煤，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)探究了加煤量、接種量、降解時(shí)間對(duì)微生物降解煤樣的影響，得到最佳降解工藝條件。選擇三種表面活性劑SDS，LAS和Triton X-100，研究添加表面活性劑后，金雀兒根瘤蒼白桿菌對(duì)陜北富油煤降解能力的變化規(guī)律和降解液相產(chǎn)物的組成。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 煤樣

實(shí)驗(yàn)所選的煤樣是陜北李家畔富油煤。將煤樣進(jìn)行破碎、研磨、篩分，選取0.25～0.5 mm煤樣(原煤)。用硝酸對(duì)煤樣進(jìn)行氧化預(yù)處理(氧化煤)[23]。煤樣經(jīng)硝酸預(yù)處理后，灰分含量較原煤減少，揮發(fā)分較原煤增加，氧含量明顯增加，硫含量減少(表1)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，這有利于微生物對(duì)煤的降解。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analysis of coal samples %

1.2 菌株與培養(yǎng)基

所用菌種為金雀兒根瘤蒼白桿菌對(duì)低階煤有較好的降解性[23]。菌種購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，編號(hào)為：23890，采用營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行菌種培育[15]。

1.3 工藝條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

1.3.1 微生物降解實(shí)驗(yàn)

將20 mL液體培養(yǎng)基接入150 mL錐形瓶，加入煤樣，滅菌冷卻后接入菌種，于30 ℃，160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，中間不斷取樣將菌絲與煤樣分離，測(cè)定煤樣降解效果?？偱囵B(yǎng)時(shí)間為20 d，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 降解效果評(píng)價(jià)和降解率計(jì)算

1)降解效果評(píng)價(jià)[25]。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)黑色降解液離心，過濾，以去離子水為參比，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定黑色降解液在450 nm處的吸光度(A450)，通過A450的值來對(duì)微生物降解煤的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，A450值越大，表明降解效果越好。

2)降解率計(jì)算。降解結(jié)束將煤樣與培養(yǎng)液和菌絲分離，80 ℃烘干測(cè)定未降解煤樣(剩煤)質(zhì)量，然后計(jì)算降解率η，即

式中η為降解率，%；m1為起始加入的煤樣質(zhì)量，g；m2為細(xì)菌作用后剩煤質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

在1.3.1實(shí)驗(yàn)條件下，分別研究加煤量(0.3,0.5,0.7,0.9 g/50 mL)、接種量(5,10,15,20,25,30 mL)、降解時(shí)間(3,6,9,12,15,18 d)對(duì)煤樣降解效果的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

利用L9(3×3)正交設(shè)計(jì)表，對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣的工藝條件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。取加煤量、接種量和降解時(shí)間3個(gè)因素，各因素分為3個(gè)水平，各因素間的交互作用不作考慮(表2)。

表2 因素水平表Table 2 Factor levels

1.4 表面活性劑對(duì)微生物降解煤過程的影響

在單因素、正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上獲得微生物降解煤樣的最佳工藝，在同等實(shí)驗(yàn)條件下，滅菌前加入50 mL濃度為0，100，200，300，400，500，600，700，800，900 mg/L的SDS液體，研究不同濃度SDS對(duì)降解率的影響。測(cè)定經(jīng)離心處理后的液相降解產(chǎn)物的A450值。采用同樣實(shí)驗(yàn)方法研究LAS，Triton X-100對(duì)微生物降解煤樣的影響。

1.5 降解液相產(chǎn)物分析

依據(jù)1.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定出對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤起最大促進(jìn)作用的表面活性劑，通過離心分離得到在最優(yōu)表面活性劑添加下的降解液相產(chǎn)物，再利用3種不同極性的有機(jī)溶劑甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，最后采用安捷倫7890A/5975C型氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行液相產(chǎn)物的組成分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 工藝條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

加煤量、接種量和降解時(shí)間對(duì)降解液吸光度的影響分別如圖1、圖2和圖3所示。隨著加煤量增加，降解液的A450值先增加后降低，加煤量為0.5 g/50 mL時(shí)，A450值達(dá)到最大(圖1)。原因可能是加煤量小于0.5 g/50 mL，菌體生存環(huán)境好，能有效降解煤樣；而加煤量大于0.5 g/50 mL，細(xì)菌生長環(huán)境變差，生長繁殖受限，不能很好地以煤為碳源生長。

圖1 加煤量對(duì)降解液吸光度的影響Fig.1 Effects of coal amount on A450 of degradation liquids

隨著接種量的增大，A450值先增大后趨于穩(wěn)定(圖2)，接種量為15 mL/ 50 mL時(shí)，A450值達(dá)到最大，再增加接種量時(shí)，A450值變化甚微。這是因?yàn)槊簶颖砻媸枪潭ǖ?，?dāng)接種量達(dá)到15 mL/ 50 mL時(shí)，煤樣與菌種接觸面達(dá)到飽和，新增加菌種不能與煤接觸，降解效果變化甚微。

圖2 接種量對(duì)降解液吸光度的影響Fig.2 Effects of inoculation size on A450 of degradation liquids

培養(yǎng)時(shí)間為15 d時(shí)，降解液A450值達(dá)到最大，15 d后波動(dòng)較小(圖3)。原因可能是菌種生存依賴于培養(yǎng)基，降解時(shí)間超過15 d時(shí)，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分耗盡，菌種停止代謝，煤樣不能繼續(xù)降解。

圖3 降解時(shí)間對(duì)降解液吸光度的影響Fig.3 Effects of degradation time on A450 of degradation liquids

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣的3個(gè)影響因素A,B,C對(duì)應(yīng)極差R分別為0.272,0.034,0.056，即A>C>B，可以得出加煤量(因素A)對(duì)降解效果影響最大，降解時(shí)間(因素C)次之，接種量(因素B)相對(duì)較小。此外，因素A所對(duì)應(yīng)A450值的3個(gè)均值K1，K2，K3最大值為0.436，因素B為0.309，因素C為0.319，得出最佳工藝為A3B3C3。即加煤量為0.7 g/50 mL，接種量為20 mL/50 mL，降解時(shí)間為18 d(表3)，此時(shí)降解效果最好，降解率為17.1%。

表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of test results

2.2 表面活性劑對(duì)微生物降解煤的影響

隨著3種表面活性劑濃度的增大，SDS作用下降解液A450值變小，LAS作用下降解液A450值先增加后趨平，Triton X-100作用下降解液A450值與LAS作用趨勢(shì)類似(圖4)。表明SDS對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣具有抑制作用，而LAS和Triton X-100具有促進(jìn)作用。

圖4 3種表面活性劑濃度對(duì)降解液A450的影響Fig.4 Effects of concentrations of three surfactants on A450 of degradation liquids

在Triton X-100作用下降解液A450值大于同濃度LAS試驗(yàn)組，Triton X-100加入濃度為800 mg/L時(shí)，降解液A450值達(dá)到最大值，微生物降解煤樣效果最好。Triton X-100加入后降解率為34.1%，比空白組增加了將近一倍(表4)。

表4 Triton X-100對(duì)降解率的影響Table 4 Effect of Triton X-100 on degradation rate

康紅麗等研究SDS，LAS和Triton X-100對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌生長過程的影響(圖5)所示[22]。在不加表面活性劑時(shí)，金雀兒根瘤蒼白桿菌在第1天的生長速率最快，2 d時(shí)就達(dá)到了生長的最高峰，這意味者該細(xì)菌在2 d內(nèi)的降解能力較強(qiáng)，尤其是第1天，細(xì)菌的活性和降解能力更強(qiáng)。當(dāng)添加LAS和Triton X-100后，細(xì)菌的生長趨勢(shì)基本沒變，也就是說LAS和Triton X-100基本不影響細(xì)菌的生長。但是，添加SDS后，金雀兒根瘤蒼白桿菌在起始期的生長基本被抑制，2 d后才快速生長，錯(cuò)過了其降解煤的最佳時(shí)間。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上佐證了圖4的結(jié)論。

圖5 3種表面活性劑對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌生長過程的影響Fig.5 Effects of three surfactants on the growth processes of ochrobactrum cytisi

2.3 表面活性劑作用下微生物降解煤樣液相產(chǎn)物分析

相對(duì)其他2種表面活性劑，TritonX-100對(duì)于對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤的促進(jìn)作用最大，并且當(dāng)Triton X-100加入濃度為800 mg/L時(shí)，降解率最大(圖4、表4)，因此，選取此時(shí)的降解液相產(chǎn)物，分別用甲苯、二氯甲烷和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取物主要組成見表5～表7。甲苯萃取液相產(chǎn)物檢測(cè)到24種化合物，相對(duì)分子量在134～422之間，組成為烷烴類物質(zhì)(72.57%)，芳香化合物(14.99%)，羧酸類、酯類(12.44%)(表5)。二氯甲烷萃取液相產(chǎn)物共檢測(cè)出22種化合物，相對(duì)分子量在142～437之間，萃取物中主要含有烷烴類(93.10%)和酯類(5.76%)，其中8號(hào)(二十五烷)含量為18.34%，14號(hào)(正二十七烷)含量為11.29%，16號(hào)(二十二烷)含量為16.41%(表6)。由表7可知乙酸乙酯萃取液相產(chǎn)物共檢測(cè)到11種化合物，相對(duì)分子量在142～390之間，鄰苯二甲酸二丁酯的含量高達(dá)71.03%?？傊鹑竷焊錾n白桿菌降解煤樣的液相產(chǎn)物種類比較豐富，含有烷烴、羧酸類、酯類、芳香化合物，相對(duì)分子量在134～437之間。烷烴類物質(zhì)是常用的工業(yè)燃料，二十二烷、二十五烷可制作潤滑劑和防腐劑，鄰苯二甲酸二丁酯可用于硝化纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯等的增塑劑。

表5 甲苯萃取物中液體產(chǎn)物的主要化合物Table 5 Main compounds of liquid products in the toluene extract

表6 二氯甲烷萃取物中液體產(chǎn)物的主要化合物Table 6 Main compounds of liquid products in the dichloromethane extract

表7 乙酸乙酯萃取物中液體產(chǎn)物的主要化合物Table 7 Main compounds of liquid products in the ethyl acetate extract

目前文獻(xiàn)報(bào)道表明SDS，LAS和Triton X-100都能降低微生物菌種和煤接觸時(shí)的界面張力，有利于菌種降解煤[18-22]。然而文中SDS對(duì)于金雀兒根瘤蒼白桿菌的起始生長期抑制作用較大，降解率表現(xiàn)出降低的現(xiàn)象。因此，表面活性劑對(duì)于煤的微生物降解的影響取決于表面活性劑對(duì)于煤和微生物界面張力的影響以及對(duì)于微生物生長的影響，是這兩方面綜合的結(jié)果。另外，表面活性劑雖然能夠促進(jìn)煤和微生物的相互吸附，影響微生物的生長和分泌物的數(shù)量，對(duì)于煤的降解速率和產(chǎn)率影響較大，但不能改變煤的結(jié)構(gòu)和微生物分泌物的組成，對(duì)于煤微生物降解產(chǎn)物的組成影響不大。

3 結(jié) 論

1)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣過程中加煤量對(duì)降解效果影響最大，降解時(shí)間次之，菌液用量影響最小。加煤量為0.7 g/50 mL，接種量20 mL/50 mL，降解時(shí)間為18 d，降解效果最好，降解率為17.1%。

2)SDS對(duì)金雀兒根瘤蒼白桿菌降解煤樣有抑制作用，LAS和Triton X-100有促進(jìn)作用，Triton X-100增加效果最為明顯，降解率為34.1%。

3)金雀兒根瘤蒼白桿菌對(duì)煤樣的降解液相產(chǎn)物種類比較豐富，含有烷烴、羧酸類、酯類、芳香化合物，相對(duì)分子量在134～437之間。利用微生物降解富油煤制備精細(xì)化學(xué)品，是富油煤清潔高效利用的有效途徑之一。