張連美，朱亞寧，孫蘇安

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院病理科，江蘇 淮安 223300

心包積液在臨床中較為常見，其中惡性腫瘤性心包積液的比例約為20%，惡性腫瘤性心包積液可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)心臟壓塞及血流動力學(xué)改變，甚至可能是腫瘤患者的首發(fā)癥狀[1]。因此，臨床上快速準(zhǔn)確地找到惡性心包積液的腫瘤來源，對后續(xù)治療和預(yù)后具有重要意義。心包積液較為隱匿，直接穿刺心包，獲取心包積液并進一步鑒定其理化性質(zhì)和細胞學(xué)成分是診斷惡性心包積液最主要的方法[2]。然而，目前尚無特異性的檢測指標(biāo)和明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，這給惡性心包積液的診斷造成了困難[3]。本研究對50例惡性心包積液標(biāo)本給予細胞蠟塊聯(lián)合基因檢測，以確定腫瘤來源，并分析肺腺癌標(biāo)本的腫瘤基因突變情況，以期為肺腺癌的個體化治療提供幫助，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月至2020年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院送檢至病理科的50例惡性心包積液患者的惡性心包積液標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。50例患者中，男31例，女19例；年齡26～85歲，平均（65.4±4.6）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

細胞學(xué)涂片及蠟塊制備：收集200～500 ml心包積液，室溫靜置20 min后，去除一半上清液，再次室溫靜置20 min，去除一半上清液，直至液體量少于50 ml，將液體收集至10 ml離心管中，共5管，室溫3000 r/min離心5 min后，去除上清液，吸取沉淀進行細胞涂片，固定后進行染色。在沉淀物中輕輕加入95%酒精，3000 r/min離心5 min，室溫下靜置2 h，去除上清液，取出沉淀物，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊，蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后在光鏡下進行觀察，記錄并分析結(jié)果。

細胞蠟塊免疫組化染色：采用全自動免疫組化染色儀進行免疫組化染色，所有抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，常規(guī)設(shè)置陽性和陰性對照。細胞蠟塊切片厚度為2.0～3.0 μm，60℃放置1 h后，根據(jù)細胞學(xué)涂片、細胞蠟塊切片中的細胞學(xué)形態(tài)以及患者的臨床病史選擇相應(yīng)的特異性免疫組化抗體，主要包括鈣網(wǎng)膜蛋白（calretinin，CR）、間皮細胞（mesothelial cell，MC）、腎母細胞瘤基因1（Wilms tumor 1，WT1）、癌胚抗原M2A單克隆抗體D2-40、尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2（caudate homeobox transcription factor 2，CDX2）、絨毛蛋白（villin）、黏蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）、天冬氨酸肽酶A（napsin A）、細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM，又稱 CD56）、嗜鉻粒蛋白 A（chromogranin A，CgA）、突觸素（synapsin，Syn）、細胞角蛋白 5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）、p63、p40、p16、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、叉 頭 框 蛋 白 A1（forkhead box A1，F(xiàn)OXA1）、配對盒轉(zhuǎn)錄因子8（paired box 8，PAX8）、糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、廣譜細胞角蛋白（pan cytokeratin，p-CK）、上皮細胞膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）、波形蛋白（vimentin）等，根據(jù)細胞蠟塊的免疫組化陽性結(jié)果判斷腫瘤來源及病理分型。

基因突變檢測：將診斷為肺腺癌來源的惡性心包積液的細胞蠟塊切成切片卷，置于1.5 ml離心管中，提取表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、棘皮動物微管相關(guān)樣蛋白4（echinoderm microtubule associated protein like 4，EML4）-間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）的DNA，試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司，具體步驟按試劑盒說明書進行操作，提取后確定DNA樣本的濃度與質(zhì)量。采用安捷倫Mx3000P實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀檢測EGFR突變情況，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）分析EML4-ALK融合基因情況，設(shè)立陰性、陽性對照，記錄兩種基因類型的陽性范圍Ct值。

2 結(jié)果

2.1 惡性心包積液細胞蠟塊組織切片觀察

惡性心包積液細胞蠟塊組織切片中，腺癌細胞呈腺樣、乳頭狀、條索狀排列或單個散在，細胞異型性明顯，核質(zhì)比例增大；鱗狀細胞癌細胞聚集呈巢團狀或片巢狀排列，細胞質(zhì)嗜酸性，細胞核深染，可見細胞間橋；小細胞癌細胞表現(xiàn)為細胞較小，但較背景淋巴細胞大，呈圓形或卵圓形、細胞質(zhì)極少，細胞核深染，部分細胞呈拉長、變形、擠壓的燕麥狀；惡性間皮瘤上皮成分常呈乳頭狀、腺樣、實性、腺泡樣、微乳頭樣排列，肉瘤區(qū)常見梭形細胞呈短束狀排列。（圖1）

圖1 轉(zhuǎn)移性肺腺癌的惡性心包積液涂片、細胞蠟塊組織切片及免疫組化染色結(jié)果

2.2 50例惡性心包積液經(jīng)細胞蠟塊結(jié)合免疫組化染色的分型診斷結(jié)果

50例惡性心包積液經(jīng)細胞蠟塊聯(lián)合免疫組化染色，結(jié)果顯示，腺癌40例，小細胞癌4例，鱗狀細胞癌5例，惡性間皮瘤l例，其中腺癌來源：肺30例，乳腺3例，消化道5例，卵巢2例。肺腺癌30例，TTF-1、napsin A、CEA均呈陽性表達；乳腺癌3例，GATA3、FOXA1均呈陽性表達，ER、PR、HER2均呈不同程度表達；消化道腺癌5例，CDX2、villin、MUC5AC均呈陽性表達；卵巢癌2例，PAX8、CA125、p16、WT1均呈陽性表達；小細胞癌4例，CD56、Syn均呈陽性表達，CgA呈不同程度表達；鱗狀細胞癌5例，CK5/6、p63、p40均呈陽性表達；惡性間皮瘤l例，CR、MC、WT1、D2-40均呈陽性表達。

2.3 腫瘤基因突變檢測結(jié)果

30例源于肺腺癌的惡性心包積液細胞蠟塊中，EGFR基因突變11例，其中19del突變5例、L858R突變6例，EML4-ALK融合基因1例，其余18例未見EGFR基因突變及EML4-ALK融合基因。（圖2）

圖2 肺腺癌患者惡性心包積液細胞胞蠟中EGFR 基因的突變情況

3 討論

當(dāng)腫瘤患者出現(xiàn)惡性心包積液并伴有胸悶、呼吸困難、心悸等癥狀時，表明患者的腫瘤已經(jīng)擴散并發(fā)展至晚期，其發(fā)生機制可能是腫瘤細胞播散于心包腔表面，導(dǎo)致心包的分泌和再吸收功能受損[4]。心包積液標(biāo)本不僅易于收集，創(chuàng)傷小，安全可靠，患者容易接受，而且能夠迅速地作出明確診斷，獲得了臨床醫(yī)師和患者的廣泛認可[5]。

本研究結(jié)合患者的臨床資料、細胞學(xué)特征及免疫組化結(jié)果分析50例惡性心包積液的組織學(xué)來源及類型，結(jié)果顯示，來源于腺癌40例、小細胞癌4例、鱗狀細胞癌5例、惡性間皮瘤1例。腺癌來源：肺30例，乳腺3例，消化道5例，卵巢2例。細胞蠟塊聯(lián)合免疫組化診斷心包積液的良惡性及判斷其來源的準(zhǔn)確率明顯高于常規(guī)細胞學(xué)涂片。與細胞學(xué)涂片相比，細胞蠟塊組織切片中腺癌細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和常規(guī)組織HE切片相似，細胞聚集呈腺樣、乳頭狀或單發(fā)散在，腫瘤細胞具有明顯的異型性，背景中的間皮細胞密集分布或平鋪分布，腺腔很少形成[6-7]。常規(guī)組織HE切片上的鱗狀細胞癌，細胞嵌套，可見細胞間橋。小細胞癌涂片和組織切片上的細胞形態(tài)相似，細胞小，呈圓形或燕麥樣，細胞質(zhì)極少，細胞界限不清[8]。一些晚期腫瘤患者的第一癥狀是體腔積液[9]。傳統(tǒng)的細胞學(xué)涂片只能對惡性腫瘤細胞進行診斷，而不能診斷其來源[10]。細胞蠟塊可連續(xù)反復(fù)切片，通過免疫組化染色可判斷腫瘤分型及部分腫瘤來源，常規(guī)細胞學(xué)涂片聯(lián)合細胞蠟塊HE染色明顯提高了惡性心包積液的診斷率[11-12]。CR、MC、WT1、D2-40是間皮細胞的標(biāo)志物，CDX2、villin、MUC5AC是消化道來源的標(biāo)志物，TTF-1、napsinA是肺腺癌的標(biāo)志物，CD56、CgA和Syn是小細胞癌的標(biāo)志物，CK5/6、p63、p40是鱗狀細胞癌的標(biāo)志物，ER、PR、HER2、GATA3、FOXA1是 乳 腺 癌 的 標(biāo) 志 物 ，PAX8、CA125、p16、WT1是卵巢癌的標(biāo)志物[13]。

近年來，肺癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，而非小細胞肺癌約占原發(fā)性肺癌的80%[14]。隨著對腫瘤發(fā)病機制的深入研究，分子靶向治療已成為肺癌治療的研究熱點，如EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）是一種應(yīng)用較為廣泛的分子靶向治療藥物[15]。EGFR基因位于人類7號染色體短臂的12～14區(qū)，包含28個外顯子，其中18～24外顯子可以編碼該受體的酪氨酸激酶部分，但超過90%的EGFR突變發(fā)生在19～21外顯子，尤其是19外顯子，約占所有突變的60%，而19外顯子堿基缺失和21外顯子的點突變往往對EGFR-TKI治療敏感。突變后EGFR可不依賴表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）而進行自激活，EGFR作為一種酪氨酸蛋白激酶受體，與相應(yīng)配體結(jié)合后激活酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK），使其磷酸化，從而激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase，PKB，又稱AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）通路和鳥嘌呤核苷酸交換因子（son of sevenless，SOS）-大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma，RAS）-迅速加速性纖維肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）-絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）-絲裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，使自噬減少，同時加速轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）、白細胞介素（interleukin，IL）-8、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌，促進腫瘤生長，使腫瘤細胞獲得不死性，進入“瘋長-分裂”的惡性循環(huán)模式。因此，EGFR的過表達或活性增強均會使細胞生長加快，自噬受到抑制，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。靶向藥物EGFR-TKI可靶向EGFR的酪氨酸激酶的胞內(nèi)區(qū)，使其活性減弱，自噬增強，從而達到治療目的。EML4-ALK融合基因是非小細胞肺癌一個重要的治療靶點。ALK包含許多重要的生物學(xué)信號通路，影響腫瘤細胞的增殖、分化與凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌患者的惡性心包積液細胞蠟塊中，EGFR基因突變11例，其中19del突變5例、L858R突變6例，EML4-ALK融合基因1例，其余18例均未見EGFR基因突變及EML4-ALK融合基因。臨床醫(yī)師可以根據(jù)基因突變情況給予患者個性化的分子靶向治療，從而改善患者的治療效果和預(yù)后。

綜上所述，惡性心包積液細胞蠟塊聯(lián)合基因檢測可為腫瘤起源及分型提供線索，并有利于肺腺癌個體化治療方案的制訂。