許合金陳東明羅日泉

(1.湛江銀恒生物科技有限公司/廣東省生物發(fā)酵飼料工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524394；2.湛江恒興珊瑚飼料有限公司，廣東 湛江 524400)

小肽一般是由2個或3個氨基酸殘基組成的寡肽，主要來源于蛋白質(zhì)水解或動物體內(nèi)。小肽能被直接吸收并進(jìn)入血液循環(huán)，且吸收利用比相同水平的氨基酸更為高效[1-3]。近年來，小肽作為一種綠色飼料添加劑在飼料工業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加小肽可以提高凡納濱對蝦[4]、星斑川鰈[5]和草魚[6]等水產(chǎn)動物的生長性能。地衣芽孢桿菌是一種兼性厭氧的芽孢桿菌，可以調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，抑制致病菌的生長和繁殖，促進(jìn)有益菌的生長。地衣芽孢桿菌作為一種飼用益生菌在我國飼料工業(yè)得到大量應(yīng)用。大量研究表明，地衣芽孢桿菌在水產(chǎn)飼料中添加可以提高大瀧六線魚[7]、鯉魚[8]和凡納濱對蝦[9]等水產(chǎn)動物的生長性能及增強(qiáng)其免疫力。蛋白酶是一種催化蛋白質(zhì)水解的酶。近年來，隨著植物蛋白源在水產(chǎn)飼料配方的比例逐漸增大，蛋白酶在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用備受關(guān)注。研究表明，蛋白酶在水產(chǎn)飼料中添加可提高水產(chǎn)動物的生長性能[10-12]，在植物蛋白用量比例大的水產(chǎn)飼料中更為明顯[10]。

小肽、地衣芽孢桿菌和蛋白酶雖然單獨(dú)作為飼料添加劑在飼料中得到了廣泛應(yīng)用，但3者同時在水產(chǎn)飼料中的添加還沒有研究報(bào)道。南美白對蝦是我國海水養(yǎng)殖的主要品種之一。為了提高南美白對蝦的養(yǎng)殖水平，增加養(yǎng)殖收益，本試驗(yàn)旨在研究添加富含小肽、地衣芽孢桿菌和蛋白酶的復(fù)合型飼料添加劑蝦肽對南美白對蝦生長性能和免疫指標(biāo)的影響，確定其適宜的添加量，為蝦肽在對蝦飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的南美白對蝦幼蝦1200尾由廣東好仕達(dá)實(shí)業(yè)有限公司提供，試驗(yàn)蝦來源于同批18日齡幼蝦，初體質(zhì)量為(2.95±0.02)g，個體均勻，健康狀況良好。

蝦肽：湛江銀恒生物科技有限公司生產(chǎn)，以南極磷蝦與豆粕為主要原料，通過耐高溫地衣芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)。其主要技術(shù)指標(biāo)：蛋白質(zhì)含量為50%，酸溶性蛋白含量為57%，蛋白酶酶活為7000U·g-1，地衣芽孢桿菌為1.3×109CFU·g-1。

將蝦肽與基礎(chǔ)飼糧，具體見表1，超微粉(過80目篩)粉碎后，然后通過V型混合機(jī)進(jìn)行充分混勻，接著添加油脂和水在圓桶式攪拌機(jī)中混合均勻，通過擠條機(jī)壓制成條狀飼料，最后通過一系列烘箱熟化、干燥、冷卻、破碎機(jī)等制成顆粒試驗(yàn)飼料。

表1 基礎(chǔ)飼料組成

1.2 試驗(yàn)分組與管理

將1200尾南美白對蝦幼蝦隨機(jī)分為4個處理組，每處理組3個重復(fù)，每個重復(fù)100尾，各重復(fù)平均體質(zhì)量無顯著差異。各組分別喂養(yǎng)添加了0%、0.05%、0.1%和0.15%蝦肽的飼料。

試驗(yàn)在廣東好仕達(dá)實(shí)業(yè)有限公司內(nèi)進(jìn)行。每天按體質(zhì)量的8%投餌，分4次定時、定量投喂，每天換水、清污，并記錄采食量，試驗(yàn)期為55d。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能

每周統(tǒng)計(jì)采食量，并于試驗(yàn)第55天稱取試驗(yàn)蝦的重量，并計(jì)算增重率、成活率以及飼料轉(zhuǎn)化率。

增重率(%)=(終末體質(zhì)量-初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100%

成活率(%)=(試驗(yàn)結(jié)束時蝦尾數(shù)/試驗(yàn)開始時投放的蝦尾數(shù))×100%

飼料轉(zhuǎn)化率(%)=(終末體質(zhì)量-初始體質(zhì)量)/飼料攝入量×100%

1.3.2 血清免疫指標(biāo)

在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個重復(fù)選取50尾蝦心臟采集血液樣品，然后置于無菌的離心管中，5000r·min-14℃離心10min，分離血清并保藏在-20℃冰箱中，用于測定血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性。使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定南美白對蝦血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性，具體測定方法參考使用說明書。

1.3.3 肝胰腺免疫指標(biāo)

在試驗(yàn)結(jié)束的當(dāng)天，每個重復(fù)選取30尾蝦采集肝胰腺，并將采集的肝胰腺其放置于-80℃冰箱凍藏備用。分析時，稱取一定質(zhì)量的肝胰腺，按照9倍體積(M∶V)加入提前在4℃冰箱中預(yù)冷的0.1 mol·L-1pH6.4的磷酸緩沖液稀釋，在冰浴中用勻漿器勻漿，將勻漿液在4℃、5000r·min-1離心10min后，取上清液，用于酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶、堿性磷酸酶和丙二醛含量的測定。使用南京建成生物工程研究所試劑盒測定南美白對蝦肝胰腺酚氧化酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶和溶菌酶的活性及丙二醛的含量，具體測定方法參考使用說明書。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS statistics 24.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果表現(xiàn)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦肽對南美白對蝦生長性能的影響

由表2結(jié)果可知，與對照組相比，添加蝦肽均可以提高對蝦增重率、成活率和飼料轉(zhuǎn)化率(P<0.05)，且隨著蝦肽添加量的增加，南美白對蝦的生長加快，成活率提高，飼料轉(zhuǎn)化率提升(P<0.05)。0.15%蝦肽組與0.1%蝦肽組相比，增重率與飼料轉(zhuǎn)化率增加幅度不大?？紤]蝦肽在飼料中的應(yīng)用成本，性價比最佳的為添加0.1%的蝦肽。與對照組相比，添加0.1%的蝦肽，增重率提高了15.15%，飼料轉(zhuǎn)化率提升了16.85%。

表2 飼料添加蝦肽對南美白對蝦生長性能的影響

2.2 蝦肽對南美白對蝦血清免疫指標(biāo)的影響

由表3結(jié)果可知，與對照組相比，添加蝦肽均可以提高對蝦血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的活性(P<0.05)，且隨著蝦肽添加量的增加，酚氧化酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶的酶活性增加，但0.15%蝦肽組與0.1%蝦肽組相比，增加幅度不大。可見，飼料添加蝦肽可以增加南美白對蝦血清的免疫指標(biāo)。

表3 飼料添加蝦肽對南美白對對蝦血清免疫指標(biāo)的影響

2.3 蝦肽對南美白對蝦對肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

飼料中添加蝦肽對南美白對蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響見表4。由表4結(jié)果可知，與對照組相比，飼糧添加蝦肽可顯著降低南美白對蝦肝胰腺組織中丙二醛的含量(P<0.05)，且隨著蝦肽含量的增加，丙二醛的含量逐漸降低；飼糧添加蝦肽可顯著增加肝胰腺組織中超氧化物歧化酶的活性(P<0.05)，且隨著蝦肽含量的增加超氧化物歧化酶的活性逐漸增加；飼糧添加小肽對酚氧化酶和堿性磷酸酶活性無顯著影響(P>0.05)。

表4 飼料添加蝦肽對南美白對蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 蝦肽對南美白對蝦生長性能的影響

李日美等研究表明，飼料中添加1.0%～2.0%的小肽可以顯著提高凡納濱對蝦幼蝦的生長性能[4]。仁澤林等研究表明，飼料中添加0.5%的小肽對南美白對蝦有明顯的促生長作用[13]。鄧岳松等研究表明，飼料中添加0.05%的植物活性小肽對史氏鱘稚魚有良好的促生長作用[14]。可見，不同的小肽在飼料中的最適添加量不同，這可能與小肽的分子量大小及來源等因素有關(guān)。本試驗(yàn)中，添加0.1%～0.15%的蝦肽對南美白對蝦有良好的促生長作用，其最適添加量在上述研究最佳添加量的范圍之內(nèi)。另外，本試驗(yàn)的蝦肽的促生長作用除了因其含有小肽外，還可能與其含有地衣芽孢桿菌與蛋白酶有關(guān)。劉強(qiáng)強(qiáng)等研究表明，飼料中添加地衣芽孢桿菌可以顯著提高凡納濱對蝦的生長性能與飼料轉(zhuǎn)化率[9]。趙覓美等研究表明，飼料中添加蛋白酶可以顯著提高吉富羅非魚的生長性能與飼料轉(zhuǎn)化率[11]。

3.2 蝦肽對南美白對蝦血清免疫指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)選用酚氧化酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶這3種具有代表性的血清非特異性免疫指標(biāo)，來評價富含小肽與地衣芽孢桿菌的蝦肽對南美白對蝦血清非特異性免疫性能的影響。

酚氧化酶是一種酚氧化酶原激活系統(tǒng)中的補(bǔ)體系統(tǒng)，其在甲殼動物免疫識別與防疫等免疫功能方面發(fā)揮重要的作用[15]。溶菌酶對革蘭氏陽性菌有明顯的抑制效果，是水產(chǎn)動物非特異免疫系統(tǒng)的重要組成部分[16]。超氧化物歧化酶是一種重要的抗氧化酶，其可以清除生物機(jī)體內(nèi)有毒性作用的活性氧，防止機(jī)體生物分子的損傷，對免疫系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用[17]。

許合金等研究表明，飼料中添加0.5%小肽優(yōu)蛋白可以顯著增加血清酚氧化酶的活性，添加2.0%的小肽優(yōu)蛋白可以顯著增加溶菌酶的活性，但對血清超氧化物歧化酶的活性沒有顯著性的影響[18]。李日美等研究表明，飼料中添加小肽可以顯著增加酚氧化酶與超氧化物歧化酶的活性，但對溶菌酶的活性無顯著性的影響[4]。可見，不同的小肽對南美白對蝦血清中酶的活性影響不同，這可能與小肽的來源與其分子量大小有關(guān)。本研究中，添加蝦肽可以顯著增強(qiáng)酚氧化酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶這3種酶的活性，與上述研究略有不同，這可能與本試驗(yàn)中蝦肽除了含有小肽外，還含有地衣芽孢桿菌。樊英等研究表明，地衣芽孢桿菌可以提高大瀧六線魚血清中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等的活性[7]。可見，地衣芽孢桿菌可以影響水產(chǎn)動物血清免疫指標(biāo)。

3.3 蝦肽對南美白對蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

肝胰腺是南美白對蝦機(jī)體內(nèi)集免疫調(diào)節(jié)和抗應(yīng)激解毒等多種功能于一體的重要器官。丙二醛是機(jī)體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性[19]。堿性磷酸酶可直接殺死侵入病原，并且可以將其進(jìn)一步水解消化，在凡納濱對蝦機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御病原的免疫反應(yīng)中起重要作用[20]。

李日美等研究表明，飼料中添加小肽可以顯著降低肝胰腺丙二醛的含量，顯著增加肝胰腺溶菌酶的活性，但對超氧化物歧化酶與堿性磷酸酶活性無顯著影響[4]。許合金等研究表明，飼料中添加小肽優(yōu)蛋白可以顯著降低肝胰腺丙二醛的含量，但對酚氧化酶、超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶活性無顯著的影響[18]。劉強(qiáng)強(qiáng)等研究表明，飼料中添加地衣芽孢桿菌可以顯著降低肝胰腺丙二醛的含量，顯著增加超氧化物歧化酶的活性，但對堿性磷酸酶和酚氧化酶無顯著的影響[9]。本研究中，飼料中添加富含小肽與地衣芽孢桿菌的蝦肽可以顯著降低肝胰腺丙二醛的含量，顯著增加超氧化物歧化酶的活性，但對酚氧化酶與堿性磷酸酶活性無顯著的影響。與上述小肽與地衣芽孢桿菌對南美白對蝦肝胰腺免疫指標(biāo)的影響基本一致。

4 結(jié)論

添加富含小肽、地衣芽孢桿菌和蛋白酶的蝦肽可以提升飼料轉(zhuǎn)化率，提升對蝦的生長性能與免疫指標(biāo)。蝦肽的最佳添加量為0.1%，與對照組相比，對蝦增重率提高了15.15%，飼料轉(zhuǎn)化率提升了16.85%。