蔡永鵬劉瓊光李敏華莫道銘

(1.佛山市高明區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務推廣中心，廣東 佛山 528000；2.華南農(nóng)業(yè)大學,廣東 廣州 510642)

粉葛為豆科葛屬植物，因具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，在廣東、廣西、湖南、江西、福建、四川、云南等地廣泛種植。然而，粉葛有多個栽培品種，其中，佛山市高明區(qū)的合水粉葛是經(jīng)國家質(zhì)檢總局審批的國家地理標志產(chǎn)品。合水粉葛在高明種植歷史悠久，種植面積較大，作為高明的特產(chǎn)，合水粉葛對于地方經(jīng)濟有著重要的意義。受種植環(huán)境、栽培措施等影響，病害發(fā)生越來越嚴重，有必要對粉葛的病害進行調(diào)查及病原菌分離鑒定，為生產(chǎn)種植過程中病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病害標本采集

在高明區(qū)更合鎮(zhèn)田間種植的粉葛，共采集218個病害標本帶回實驗室，用于病害鑒定。

1.1.2 常用培養(yǎng)基及緩沖液

1.1.2.1 PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水定容到1L，121℃滅菌20min。

1.1.2.2 LB培養(yǎng)基

胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，蒸餾水定容至1L，121℃滅菌20min。

1.1.2.3 1×TBE

54g Tris堿，27.5g硼酸，20mL0.5mol·L-1的EDTA(PH8.0)加1L水溶解，使用時稀釋5倍。

1.1.2.4 0.5mol·L-1EDTA(pH8.0)

在800mL水中加入186.1g EDTA，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。

1.1.3 生化試劑及其他材料

Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer等；DNA分子量標準DL 2000(DL2000DNAMarker)；DNA凝膠回收試劑盒；胰蛋白胨、酵母提取物(Yeast Extract)、瓊脂(Agar)、葡萄糖、蔗糖等。

1.1.4 主要儀器

超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)搖床、低溫冰箱、超純水器、滅菌鍋、PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電子天平、分析天平、微波爐、金屬浴等。

1.2 試驗方法

將采回的標本先在顯微鏡下觀察病原菌噴菌現(xiàn)象，初步確定是侵染性病害還是非侵染性病害。

1.2.1 病原真菌分離

利用組織分離法對粉葛炭疽病菌進行分離，在超凈臺中，取帶明顯病害癥狀的植物葉片和莖組織，用雙蒸水沖洗。取病健交界處的組織，用經(jīng)無菌處理的手術(shù)刀裁剪成4～5mm大小的片狀物或塊狀物，用75%的酒精漂洗1min，再放到0.1%的次氯酸鈉溶液中漂洗3min。消毒后，用雙蒸水沖洗3～4次。用已滅菌的鑷子抓取消毒漂洗過的組織塊，以每皿4～5塊的數(shù)量，均勻排放在PDA平板上，放好后輕微按壓，直到培養(yǎng)皿倒放時不會掉落。在培養(yǎng)皿上用記號筆記錄相應信息。將載有組織塊的培養(yǎng)皿倒置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，4d后在超凈臺中，挑選培養(yǎng)基上未污染的菌落，用接種環(huán)在菌落邊緣挑取1小塊培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，將有菌絲的那一面朝下接觸培養(yǎng)基。多次重復試驗，直到僅分離出1種菌。

1.2.2 科赫氏法則驗證和致病性測定

在室內(nèi)進行病原菌的致病性測定，用70%的酒精將健康粉葛莖切段進行表面消毒，并用雙蒸水沖洗3次，放置在已經(jīng)進行消毒的搪瓷托盤中。在粉葛莖稈切段的表面用已滅菌的針刺小孔。選取菌落直徑已大約長至70mm的疑似病原菌的PDA培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基最外圍真菌生長最旺盛的部分，用已滅菌的打孔器打孔，獲得約7mm的菌餅。將打孔獲得的菌餅覆蓋在粉葛莖稈切段表面的小孔上，并以空白PDA培養(yǎng)基作為對照。接著，每日用噴壺對粉葛莖切段表面噴灑雙蒸水，放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中，約4d后待粉葛莖切段出現(xiàn)發(fā)病情況，觀察并記錄是否出現(xiàn)與前期采集到的病株相同的癥狀。

若有發(fā)病，再從發(fā)病處取組織，對病原菌進行分離純化，觀察是否獲得同分離步驟相同的致病菌，以此完成柯赫氏法則的驗證。

1.2.3 病原真菌鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學觀察

將經(jīng)柯赫氏法則驗證后的菌株，轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7d，待菌落長到約70mm。對培養(yǎng)后的菌落外觀、菌絲和分生孢子等形態(tài)特征進行觀察，查找資料，進行形態(tài)學的鑒定，能夠初步鑒定到病原菌的屬。

1.2.3.2 分子生物學鑒定

選取經(jīng)過驗證，確實為致病菌的菌株，在超凈臺中刮下茂盛的菌絲至離心管中，令菌絲質(zhì)量大約為100mg，來進行菌株的DNA的提取。完成真菌DNA提取后，對獲得的DNA進行PCR擴增、序列測序和結(jié)果分析。PCR擴增體系如表1所示。

表1 PCR擴增體系

1.2.3.3 PCR反應參數(shù)

預變性94℃，5min；變性94℃，45s；退火53℃，45s；延伸72℃，1min；共35個循環(huán)。再延伸72℃，10min。擴增完將產(chǎn)物放入4℃冰箱中進行保存。將PCR擴增所得的DNA產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗，將電泳產(chǎn)物在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察。選取擴增條帶清晰約540bp(base pair)的目標條帶將其切下，進行凝膠回收。PCR擴增產(chǎn)物送到上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序。在DNAman軟件中拼接測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列的BLAST比對分析。

2 結(jié)果與分析

在高明區(qū)更合鎮(zhèn)田間種植的粉葛，共采集218個病害標本，經(jīng)顯微鏡觀察，鑒定出常見的幾種真菌病害。

2.1 粉葛擬銹病

粉葛擬銹病是一種常見發(fā)生的病害。該病除了危害葉片、葉柄外，還危害葛藤，通常在葉脈和葉柄處病斑最多，發(fā)病初期先出現(xiàn)褪綠黃斑，嚴重時形成黃色泡狀隆起，見圖1，后期在莖上呈腫瘤狀，破裂后有黃色膿狀物質(zhì)散出，受害葉片容易早落，嚴重時植株萎蔫枯死。據(jù)調(diào)查，粉葛擬銹病每年4月開始零星發(fā)生，到12月收獲期內(nèi)都有發(fā)生，其發(fā)病特點是高溫干旱時發(fā)病輕，梅雨季節(jié)發(fā)病重，病害嚴重田塊，病株率達90%～100%。由葛藤集壺菌(Sychytrium puerariae)引起，見圖2。

圖1 粉葛擬銹病發(fā)病癥狀

圖2 粉葛擬銹病菌顯微鏡下觀察孢子囊形態(tài)

2.2 粉葛棒孢霉葉斑病

該病主要危害葉片、葉柄及葛藤，形成多角形或不規(guī)則形黑色病斑，見圖3，潮濕環(huán)境下，病部產(chǎn)生黑色霉體，即為病原菌的分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗褐色，有分隔；分生孢子棍棒狀，有多個隔膜，褐色，見圖4。

圖3 粉葛棒孢霉葉斑病為害癥狀

圖4 棒孢霉真菌分生孢子形態(tài)

2.3 粉葛白絹病(Selerotium rolfsii)

白絹病主要危害粉葛塊莖或莖基部，起初莖基部的表皮會變成褐色，隨后莖基部表皮上會出現(xiàn)一些病斑，多數(shù)情況下病斑無規(guī)則。隨著病情的發(fā)展，發(fā)病部位逐漸腐爛，表面或近地面土表覆有白色絹絲狀菌絲體。后期在菌絲體內(nèi)形成很多油菜籽狀的小菌核，初為白色，后漸變?yōu)榈S色至黃褐色，見圖5。白絹病是一種典型的土傳病害，寄主范圍廣，能夠侵染許多作物，導致嚴重危害。

圖5 粉葛白絹病在葛根上癥狀

2.4 粉葛枯萎病

粉葛枯萎病是一種土傳病害，主要危害粉葛塊根及莖蔓基部，近年在葛藤上也發(fā)現(xiàn)該病的危害。該病可在粉葛的全生育期發(fā)生，其中以6—8月發(fā)病最多，特別是臺風過后會有發(fā)病高峰期。粉葛感病前期，葛根的尖端或中部表皮會出現(xiàn)褐色的水漬狀病斑，靠近土表的莖蔓基部最容易發(fā)病，病部不規(guī)則形，病部變黑，莖開裂，濕度大時，可見病部產(chǎn)生大量的粉紅色霉體(分生孢子)，感病后期莖基部皮下組織變褐色，出現(xiàn)干腐現(xiàn)象，植株逐漸萎蔫，枯死，見圖6。

圖6 粉葛枯萎病發(fā)病癥狀

2.5 粉葛炭疽病菌的分離和鑒定

2.5.1 癥狀觀察

炭疽病菌可侵染粉葛的葉片、藤蔓和莖。葉片上呈現(xiàn)近圓形或不規(guī)則灰褐色斑點，邊緣處呈現(xiàn)暗褐色，病斑外圈伴隨有少許黃暈，嚴重的葉片出現(xiàn)大面積變色。粉葛藤蔓出現(xiàn)多處壞死，病部有褐色病斑，病斑沿著莖稈縱向發(fā)展，為長橢圓形，見圖7。嚴重時莖部開裂，出現(xiàn)枯萎和腐爛癥狀。濕度較大時，病部可見紅色粘質(zhì)(分生孢子)。

圖7 粉葛炭疽病在葉片和莖上田間癥狀

2.5.2 病原菌的分離

選取病健交界處的病害組織進行平板培養(yǎng)，培養(yǎng)4d后挑選分離較好的從組織塊長出來的真菌，并轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。再次培養(yǎng)4d后，得到疑似病原真菌12個，將這12個疑似病原菌進行驗證。

2.5.3 病原菌的致病性測定

將上述分離出的12個疑似致病菌，進行致病性測定，結(jié)果表明，有5個分離物出現(xiàn)了與田間炭疽病相同癥狀，見圖8。進一步分離，得到相同真菌菌落。

圖8 炭疽病菌接種粉葛莖和葉片發(fā)病癥狀

2.5.4 病原菌的形態(tài)特征

粉葛炭疽病菌在PDA培養(yǎng)基上形成近圓形菌落，菌絲顏色為白色，菌絲較長且茂盛，質(zhì)地長絨毛狀或絮狀，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落變?yōu)楹诤稚?，見圖9。

圖9 粉葛炭疽病菌在PDA平板上的菌落形態(tài)

在顯微鏡下觀察，其分生孢子著生在分生孢子盤上，分生孢子梗無色，分生孢子單胞無色，橢圓形或長圓柱形，內(nèi)含2個油球，見圖10。根據(jù)分生孢子的形態(tài)初步判斷，致病菌屬于炭疽菌屬(Colletotrichum)。

2.5.5 病原菌的分子生物學鑒定

利用ITS通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)對FGCG08菌株進行PCR擴增，將擴增后的純化PCR產(chǎn)物進行測序。得到577bp長度的產(chǎn)物。

圖10 炭疽病菌FGCG08在顯微鏡下觀察的分生孢子形態(tài)

將測序結(jié)果進行同源性對比，發(fā)現(xiàn)致病菌的序列在Genbank中與膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的同源性達到98%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖11。結(jié)合病原菌的形態(tài)學特征，將病原菌鑒定為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

圖11 粉葛炭疽病菌FGCG08菌株ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)束語

本文通過對合水粉葛常見病害調(diào)查及病原菌分離鑒定，鑒定出5種真菌病害，粉葛棒孢葉斑病、粉葛炭疽病、粉葛銹病、粉葛白絹病、粉葛枯萎?。缓喴枋隽?種病害的為害特征，并就粉葛炭疽病作了詳細的病原菌分離和鑒定，得出粉葛炭疽病是由膠孢炭疽菌引起的，為生產(chǎn)上粉葛病害的有效防治提供了科學依據(jù)。