于淼 梁瑞娜 陳營(yíng)

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

海帶(Laminaria japonica)又名昆布、綸布和江白菜等，屬于褐藻門、褐藻綱、海帶目、海帶科、海帶屬，是一種生長(zhǎng)在海洋中的大型褐藻，是我國(guó)歷史最悠久的食用和藥用藻類之一[1]。海帶是我國(guó)高產(chǎn)藻類作物，具有獨(dú)特的工業(yè)和食用價(jià)值，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)以及維生素，還含有豐富的生理活性物質(zhì)，如褐藻酸、褐藻糖膠、褐藻淀粉、海帶多酚、褐藻纖維、甘露醇、高不飽和脂肪酸、巖藻黃質(zhì)和甾醇類化合物等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，海帶不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有很高的藥用價(jià)值，海帶具有抗氧化、抗病毒、抗癌、抗腫瘤、抗菌消炎等多種生理活性，是當(dāng)前研究的重點(diǎn)之一[3]。隨著不斷深入研究，海帶中的多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化性，逐漸成為研究熱點(diǎn)。此外，萜類、甾醇類和大環(huán)內(nèi)酯類等海藻次生代謝物質(zhì)也受到廣泛關(guān)注[4]。

芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌是一種革蘭氏陽性菌。研究表明，芽孢桿菌具有較強(qiáng)的纖維素酶、蛋白酶、淀粉酶等多種活性，其可以抑制或破壞周圍其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。這種細(xì)菌不但可以產(chǎn)生芽孢來抵抗外界有害因素，并且分布廣泛，在土壤、水和空氣中都存在，抑菌范圍很廣[5]。作為一種益生菌，在攝入足夠數(shù)量芽孢桿菌后能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生健康益處[6]。芽孢桿菌的生物學(xué)活性比其他益生菌具有更多的優(yōu)點(diǎn)，是目前重點(diǎn)研究的益生菌之一。

由于目前抗生素的濫用導(dǎo)致抗生素的耐藥性以及殘留量問題日益增多，因此選擇一種無毒無殘留的肥料顯得尤為重要。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌與海帶均可在肥料中使用，且與其他益生菌相比，芽孢桿菌的生物活性具有更多優(yōu)點(diǎn)。因而，芽孢桿菌的開發(fā)和應(yīng)用受到廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以干海帶為原料，通過以海帶為碳源培養(yǎng)芽孢桿菌，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行生物學(xué)活性研究(活菌計(jì)數(shù)以及抗氧化性研究)，從而篩選出優(yōu)良的益生菌發(fā)酵菌株，在今后開發(fā)藻類食品、功能食品、醫(yī)用食品、化妝品以及綜合高效利用藻類方面提供幫助[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

購(gòu)買于煙臺(tái)長(zhǎng)島縣海帶養(yǎng)殖場(chǎng)的干海帶。

1.1.2 菌種

實(shí)驗(yàn)室保存的從海帶樣品中分離的芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏3g，蛋白胨10g，瓊脂15～20g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，pH7.0。

1.1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)

海帶30g，(NH4)2SO40.3g，NaCl 0.5g，吐溫80 0.1mL，維氏鹽溶液5mL，水100mL，pH6.8～7。

1.1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基B(對(duì)照B組)

蛋白胨0.5g，酵母膏0.1g，NaCl 0.5g，維氏鹽溶液5mL，水100mL，pH6.8～7.2。

1.2 方法

1.2.1 利用海帶培養(yǎng)芽孢桿菌及其發(fā)酵液的制備

1.2.1.1 芽孢桿菌的種子液制備

將純化的芽孢桿菌接種于滅過菌的50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，混勻后置于恒溫振蕩器中(37℃，160r·min-1)振蕩培養(yǎng)1d[7]，作為種子液。

1.2.1.2 芽孢桿菌的海帶發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)分為3組，包括實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照A組和對(duì)照B組。

實(shí)驗(yàn)組：干海帶使用前用自來水浸泡4h，期間1h換1次水。清洗海帶除去表面的泥沙，將海帶攪碎成長(zhǎng)寬大約為7mm的碎塊，取30g放入300mL的三角瓶中，加入100mL配置好的發(fā)酵培養(yǎng)基，封裝好后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121℃、20min)。取種子液，按5%接種到滅過菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后置于恒溫振蕩器中(37℃，160r·min-1)振蕩培養(yǎng)，至海帶片90%以上分解。繼續(xù)傳代培養(yǎng)2次，直至海帶分解效果穩(wěn)定。

對(duì)照組A：將浸泡好的海帶清洗除去表面的泥沙，稱取30g研磨成糊狀，置于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，121℃、20min進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。

對(duì)照組B：取種子液，按5%接種到滅過菌的100mL發(fā)酵培養(yǎng)基B中，混勻后置于恒溫振蕩器中(37℃，160r·min-1)振蕩培養(yǎng)1d；繼續(xù)傳代培養(yǎng)2次。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù)

分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照B組最后1次發(fā)酵液0.5mL，進(jìn)行10倍系列稀釋至10-7。分別取10-4～10-7稀釋度，用移液槍吸取10μL稀釋的發(fā)酵液于3cm高度垂直滴在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋度滴3滴，每個(gè)平板滴4個(gè)稀釋度，恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2d[8]。

活菌數(shù)(CFU·mL-1)=3滴平均菌落數(shù)×100×稀釋倍數(shù)

1.2.3 抑菌性測(cè)定

分別取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌平板上的菌落制備成菌懸液，測(cè)定625nm下的吸光度，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)2種菌懸液至吸光度0.1，用移液槍各取0.1mL稀釋的菌懸液滴在牛肉膏蛋白胨平板并涂布。

取適量實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照A組、對(duì)照B組最后1次發(fā)酵液，將無菌濾紙片完全浸透后，每種培養(yǎng)液各取1個(gè)濾紙片(直徑6mm)等距鋪于上述涂布指示菌的平板上，做3組平行，35℃倒置培養(yǎng)1～2d，后觀察有無抑菌圈產(chǎn)生并且測(cè)量抑菌圈大小，結(jié)果取平均值。

1.2.4 抗氧化性測(cè)定

抗氧化能力采用南京建成生物研究所的試劑盒(超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒、DPPH自由基清除能力試劑盒、羥自由基測(cè)試試劑盒)測(cè)定。

1.2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除能力

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出實(shí)驗(yàn)組5%、對(duì)照A組10%、對(duì)照B組5%濃度為最佳取樣濃度，取此濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。將樣品離心后取上清測(cè)定。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果把樣本稀釋成相應(yīng)的稀釋液，配制好工作液，按操作表依次添加試劑，將上述各管混勻，室溫25℃避光靜置30min后，4000r·min-1離心5min，吸取800μL至比色皿中，無水乙醇做對(duì)照，在517nm處測(cè)定各比色皿的吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DPPH自由基清除能力，計(jì)算公式：

DPPH自由基清除能力(μgTrolox·mL-1)=代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)于Trolox的濃度×稀釋倍數(shù)

1.2.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出實(shí)驗(yàn)組5%、對(duì)照A組10%、對(duì)照B組5%濃度時(shí)，抑制率在40%～50%，為最佳取樣濃度，因此取此濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

在超凈工作臺(tái)用1mL移液槍從3組發(fā)酵液中吸取樣本至5mL EP管中，在高速離心機(jī)中以2000r·min-1離心2min，離心后取出，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果把樣本稀釋成相應(yīng)的稀釋液，接著把應(yīng)用液配制好，按操作表依次添加試劑，充分混勻后放入水浴鍋中(水浴鍋設(shè)置37℃，提前預(yù)熱)，恒溫水浴40min，取出后加入顯色劑終止反應(yīng)，混勻，室溫靜置10min，蒸餾水作對(duì)照，1cm光徑，在550nm處測(cè)定吸光度。

抑制超氧陰離子的能力計(jì)算公式：

抗超氧陰離子活力單位(U·L-1)=(對(duì)照OD值-測(cè)定OD值)÷(對(duì)照OD值-標(biāo)準(zhǔn)OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.15mg·mL-1)×1000mL×樣品測(cè)試前的稀釋倍數(shù)

1.2.4.3 對(duì)羥自由基的清除能力

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出實(shí)驗(yàn)組5%、對(duì)照A組15%、對(duì)照B組15%濃度時(shí)，為最佳取樣濃度，所以取此濃度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

提前配制需要的應(yīng)用液并打開水浴鍋設(shè)置為37℃，將應(yīng)用液置于水浴鍋中預(yù)熱3min，按操作表依次添加試劑，充分混勻后，置于37℃水浴鍋中反應(yīng)1min，立即加入顯色劑終止反應(yīng)?；靹?，室溫放置20min后，蒸餾水作對(duì)照，在550nm處測(cè)吸光度。

抑制羥自由基的能力公式：

抑制羥自由基能力(U·mL-1)=(對(duì)照OD值-測(cè)定OD值)÷(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(8.824mmol·L-1)×1mL÷取樣量×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 芽孢桿菌的活菌計(jì)數(shù)

用滴種法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)平均值為3.44×108CFU·mL-1，對(duì)照B組活菌數(shù)平均值為2.22×108CFU·mL-1，見表1，加入海帶發(fā)酵培養(yǎng)基中(實(shí)驗(yàn)組)的活菌數(shù)是未加海帶的發(fā)酵培養(yǎng)基(對(duì)照B組)的1.5倍。

表1 不同培養(yǎng)基活菌計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 芽孢桿菌的抑菌性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照A組與對(duì)照B組對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無抑菌性，結(jié)果見圖1。由此可知，芽孢桿菌發(fā)酵液并無抑菌性，在發(fā)酵液中加入海帶后也未發(fā)現(xiàn)有抑菌性。

圖1 芽孢桿菌發(fā)酵液的抑菌實(shí)驗(yàn)

2.3 抗氧化性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照A組、對(duì)照B組抗氧化能力如表2所示。

3組發(fā)酵液清除DPPH自由基能力比較得出，實(shí)驗(yàn)組清除DPPH自由基能力顯著高于對(duì)照A組與對(duì)照B組(P<0.01)，且是對(duì)照A組、對(duì)照B組的2倍左右。海帶研磨液和芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵液本身均具有清除DPPH自由基的能力，兩者相當(dāng)，沒有顯著性差異。在培養(yǎng)基中加入海帶碎片后再發(fā)酵，芽孢桿菌清除DPPH自由基的能力顯著增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)組清除超氧陰離子自由基能力略高于對(duì)照B組(P<0.05)，顯著高于對(duì)照A組(P<0.01)?？芍?，海帶研磨液清除超氧陰離子自由基的能力比較低，芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵液本身清除超氧陰離子自由基的能力較高，二者差異顯著。加入海帶碎片后再發(fā)酵，芽孢桿菌清除超氧陰離子自由基的能力略有增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)組清除羥自由基能力顯著高于對(duì)照A組與對(duì)照B組(P<0.01)，分別是對(duì)照A組的3.5倍和對(duì)照B組的2.5倍。海帶研磨液清除羥自由基的能力很低，芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵液本身清除羥自由基的能力略有提高，兩者差異不顯著。加入海帶碎片后再發(fā)酵，芽孢桿菌清除羥自由基的能力顯著增強(qiáng)。

表2抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

3 討論

海帶的細(xì)胞壁中含有的海藻酸和其他多糖成分，是微生物生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能源。某些微生物能利用這些物質(zhì)將其降解成小分子，破壞細(xì)胞壁的保護(hù)結(jié)構(gòu)，釋放出細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]。李博強(qiáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源海藻糖含量增高時(shí)，酵母拮抗菌的活力增強(qiáng)，同時(shí)提高對(duì)蘋果青霉病的防治效果。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)內(nèi)源海藻糖含量增高，還能夠減少細(xì)胞活性氧的積累。在本實(shí)驗(yàn)中，通過海帶發(fā)酵培養(yǎng)芽孢桿菌，發(fā)酵液中的活菌數(shù)是芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵液的1.5倍，說明海帶分解產(chǎn)生的某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠提高芽孢桿菌細(xì)胞活力，使細(xì)菌分裂能力增強(qiáng)，活菌數(shù)增多。另外還發(fā)現(xiàn)，通過海帶發(fā)酵能提高芽孢桿菌的抗氧化能力，有效清除細(xì)胞中的活性氧。但未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的抑菌能力。

生物體在進(jìn)行生命活動(dòng)過程中，有氧自由基不斷積累，當(dāng)氧自由基數(shù)量過多時(shí)會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體的衰老。正常生長(zhǎng)的作物，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生傷害，但在生育后期，這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，活性氧不斷產(chǎn)生。當(dāng)活性氧積累到一定程度時(shí)，會(huì)引發(fā)或加劇細(xì)胞膜脂過氧化或膜脂過氧化作用，對(duì)膜系統(tǒng)造成損傷，致使作物衰老加劇[11]。其中，羥自由基在眾多氧自由基中活性最強(qiáng)，DPPH自由基清除率常被用來表征物質(zhì)的抗氧化能力[12]。在人體內(nèi)存在未發(fā)生化學(xué)變化的超氧陰離子自由基，對(duì)正常生命活動(dòng)沒有影響，但與羥基結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生一種物質(zhì)，會(huì)損壞細(xì)胞DNA，對(duì)人體造成危害。海藻多糖作為海帶中廣泛存在的一類具有生物活性的成分，具有良好的抗氧化活性，能夠減少活性氧對(duì)人體的損傷。有實(shí)驗(yàn)證明，多形核白細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生活性氧自由基時(shí)，低濃度海藻多糖能夠直接清除這些活性氧自由基，高濃度海藻多糖能阻止生成活性氧[2]。在抗氧化實(shí)驗(yàn)中可知，海帶研磨液(對(duì)照A組)與芽孢桿菌發(fā)酵液(對(duì)照B組)本身具有清除氧自由基的能力，在芽孢桿菌發(fā)酵液中加入海帶碎片(實(shí)驗(yàn)組)后，其抗氧化能力明顯提高。微生物是藻類多糖的主要分解者[13]，芽孢桿菌分解海帶，將存在于海帶細(xì)胞壁中的海藻多糖釋放，而海藻多糖分子中含有的半縮醛羥基具有弱解離能，當(dāng)其給氧自由基提供電子時(shí)，使氧自由基活性降低，從而使實(shí)驗(yàn)組抗氧化能力(抗DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力)增強(qiáng)。另外有實(shí)驗(yàn)證明，與分解前相比，海帶分解后發(fā)酵液上清液中的海藻多糖、巖藻糖明顯增多，可能是菌株生長(zhǎng)過程中能夠分泌某種胞外酶，這種胞外酶對(duì)海帶有降解作用[14]?？刹聹y(cè)，芽孢桿菌分解海帶過程中能夠分泌某種酶，在酶的作用下使發(fā)酵液中海藻多糖、巖藻多糖迅速增多，在這些多糖的作用下發(fā)酵液中抗氧化物酶如超氧化物歧化酶等活性增強(qiáng)，從而提高自由基的清除率。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，人們對(duì)高產(chǎn)量、高質(zhì)量農(nóng)產(chǎn)品的需求也不斷增加。在這種需求下，有機(jī)肥和微生物菌劑在當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中越來越受重視，二者結(jié)合在一起使用被稱為生物肥料。作為一類含有有益微生物的制品，生物肥料不僅能夠增加土壤有益微生物、提高土壤活性、改良土壤，還可以保護(hù)生態(tài)環(huán)境，有利于推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[15]。海帶作為一種豐富的海洋資源，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛。海帶具有生物刺激素作用，可作為增效劑，當(dāng)與化學(xué)肥料搭配使用時(shí)，不僅能提高肥料的利用效率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，還能充分發(fā)揮海藻多糖等物質(zhì)抗氧化作用[16]。本實(shí)驗(yàn)通過探究海帶發(fā)酵液培養(yǎng)芽孢桿菌對(duì)其生物學(xué)活性的影響，得出利用海帶作為藥用基質(zhì)培養(yǎng)芽孢桿菌能夠提高其生物學(xué)活性的結(jié)論。另外，海帶和芽孢桿菌易獲取、成本低，二者結(jié)合既可提供大量的活性物質(zhì)，也可以降低對(duì)環(huán)境的危害，或許可以作為一種生物肥料應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。