冷曉飛
(大連海寶漁業(yè)有限公司,遼寧 大連 116045)
皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)是中國(guó)沿海重要的養(yǎng)殖珍品之一。野生資源減少和市場(chǎng)需求增加,皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)作為重要海珍品的工廠化人工育苗迅速發(fā)展。隨著集約化程度的提高,皺紋盤鮑苗種生產(chǎn)中病害頻發(fā),鮑苗大量死亡,造成很大經(jīng)濟(jì)損失[1,2]??股厥欠乐尾『Φ膫鹘y(tǒng)藥物,但頻繁使用抗生素導(dǎo)致病原體產(chǎn)生耐藥性,加大了病害的防治難度;殘留于鮑體內(nèi)的抗生素對(duì)消費(fèi)人群的健康構(gòu)成了潛在威脅,限制了出口貿(mào)易[3]。因此皺紋盤鮑苗種生產(chǎn)中急需更好更有效的方法防治病害。
益生菌能抑制有害菌的生長(zhǎng)、提供營(yíng)養(yǎng)成分且能強(qiáng)化動(dòng)物腸道黏膜屏障等[4,5]。近些年來,水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的研究逐漸深入,益生菌對(duì)鮑益生作用的相關(guān)研究也有持續(xù)的報(bào)道。Macey 等[6]在餌料中添加弧菌和兩株酵母菌顯著提高了南非中間鮑Haliotis midae 生長(zhǎng)及抗病力。Doeschate 和Coyne[7]用南非中間鮑腸道內(nèi)的交替假單胞菌Pseudoalteromonas tetraodonis 制劑顯著提高了該鮑的生長(zhǎng)。Lehata 等[8]發(fā)現(xiàn),由腸道分離的片球菌Pediococcus sp.Ab1 很好地促進(jìn)了日本大盤鮑Haliotis gigantea(madake)的生長(zhǎng)。蔣慶茹等[9]分離和鑒定了雜色鮑Haliotis diversicolor 腸道益生菌。蛭弧菌Vibrio bdello 制劑有利于九孔鮑Haliotis diversicolor aquatilis 的生長(zhǎng)和存活[10]。楊寶麗[11]研究了皺紋盤鮑養(yǎng)殖水體及其消化道中細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化特征。劉麗等[12]發(fā)現(xiàn),紅假單胞菌Rhodopseudomonas sp.和枯草芽孢桿菌Bacillus Subtilis(Ehrenberg)Cohn 的混合菌液可提高皺紋盤鮑的免疫力,促進(jìn)皺紋盤鮑生長(zhǎng)。郭衍彪等[13]發(fā)現(xiàn)蛭弧菌對(duì)皺紋盤鮑腸道微生態(tài)具有積極影響。冷曉飛等[14]分析了皺紋盤鮑腸道菌群的結(jié)構(gòu)。姜海峰等[15,16]從皺紋盤鮑腸道中篩選出5 種潛在益生菌,其中希瓦氏菌Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65)對(duì)鮑魚病原菌燦爛弧菌Vibrio splendidus 和哈維弧菌Vibrio harveyi 具有較好拮抗效果。凌宇恒等[17]研究了鮑腸道益生菌芽孢桿菌Bacillus stratosphericus 的培養(yǎng)條件。益生菌制劑具有環(huán)保綠色的特點(diǎn),研發(fā)益生菌制劑為解決鮑苗病害和藥殘問題帶來了新思路。
底棲硅藻餌料到人工餌料轉(zhuǎn)換期、高溫期和高溫期過后(水溫降至23℃以下)期是影響皺紋盤鮑苗成活率和生長(zhǎng)率的關(guān)鍵時(shí)期。本課題組曾在人工餌料中添加希瓦氏菌(WA64 和WA65)制劑,有效降低了高溫期鮑苗的死亡量[15]。但希瓦氏菌對(duì)餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期過后皺紋盤鮑幼鮑生長(zhǎng)和存活的影響尚無研究。
本研究在餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期過后時(shí)期,將希瓦氏菌WA64 和WA65 添加到人工餌料中飼喂幼鮑,探討益生菌復(fù)合制劑對(duì)這兩個(gè)時(shí)期幼鮑生長(zhǎng)和存活的影響,為鮑的人工育苗提供技術(shù)參考。
實(shí)驗(yàn)中用皺紋盤鮑幼鮑來自大連海寶漁業(yè)有限公司育苗場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)用希瓦氏菌菌株WA64 和WA65 來源于大連海寶漁業(yè)有限公司遼寧省工程技術(shù)研究中心。
菌液培養(yǎng):用接種環(huán)取斜面保藏的WA64 和WA65 菌種,分別在2216E 瓊脂(瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%)培養(yǎng)基平板上劃線,28℃恒溫培養(yǎng)48 h,挑單菌落,無菌條件下轉(zhuǎn)移到10 mL 海洋2216E 液體培養(yǎng)基中,搖床(140 r/min,28℃)培養(yǎng)16 h。獲得的種子菌液,再在無菌條件下轉(zhuǎn)移到300 mL 或3 000 mL(依實(shí)驗(yàn)需求量確定)海洋2216E 液體培養(yǎng)基中,搖床(140 r/min,28℃)培養(yǎng)48 h,獲得WA64 和WA65菌液,定量后,放到冷藏柜中,在4℃條件下保藏待用。
菌苔培養(yǎng):用2216E 瓊脂(瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%)培養(yǎng)基倒大平板(培養(yǎng)皿直徑18 cm),用涂布棒將1 mL WA64(或WA65)種子菌液在大平板培養(yǎng)基表面涂均勻,在恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h 后,于超凈臺(tái)內(nèi)加入10 mL 滅菌海水,用涂布棒刮取菌苔,轉(zhuǎn)移到燒杯中,用血球計(jì)數(shù)板定量后冷藏備用。
1.2.1 餌料轉(zhuǎn)換期實(shí)驗(yàn)
15 個(gè)長(zhǎng)8 m×寬1.3 m 培育池分成A、B、C、D和E 5 組,每組3 個(gè)重復(fù)。每個(gè)培育池投放從底棲硅藻板上剝離下來的殼長(zhǎng)(0.35±0.09)cm(n=100)皺紋盤鮑幼鮑8 萬枚,水溫(17±2)℃,日流水量為4倍飼育水體,每日投餌一次。A 組投喂正常人工餌料,B、C 和D 組分別投喂添加低(107cells/g 餌料)、中(108cells/g 餌料)和高(109cells/g 餌料)劑量復(fù)合菌苔制劑(WA64 和WA65)的餌料。E 組投喂添加中劑量(108cells/g 餌料)復(fù)合菌液制劑餌料。菌劑在投餌前半小時(shí)拌入餌料中。每日清理、計(jì)數(shù)各實(shí)驗(yàn)池死亡鮑苗,觀察各個(gè)實(shí)驗(yàn)池排水管濾網(wǎng)上殘餌和粘稠情況、排水管廢水下落處水泥地面粘滑情況。飼養(yǎng)56 d 時(shí)鮑苗分苗培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)各池中殼長(zhǎng)0.9 cm以上的幼鮑數(shù)量。
1.2.2 高溫期過后時(shí)期實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)用10 個(gè)皺紋盤鮑苗種培育池,規(guī)格、形態(tài)同1.2.1,依次編號(hào)1~10 號(hào)。每個(gè)培育池投放殼長(zhǎng)(2.13±0.22)cm(n=100)、體質(zhì)量1.24 g 皺紋盤鮑幼鮑26.2 kg,其中1、3、5、7、9 號(hào)池投喂正常人工餌料,作為對(duì)照組;2、4、6、8、10 號(hào)池投喂添加菌苔制劑人工餌料(WA64 和WA65 濃度為108cells/g 餌料),作為處理組。實(shí)驗(yàn)水溫15.8~23.2℃,日流水量為3~5 倍飼育水體,每日投餌一次。每日清理各池死亡鮑苗數(shù)。飼養(yǎng)67 d 時(shí),統(tǒng)計(jì)各池中鮑苗的產(chǎn)量(重量)、數(shù)量、殼長(zhǎng)2.2 cm 以上商品苗種數(shù)量,鮑苗的殼長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用spss17.0 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)分析,顯著性水平為0.05。
攝食人工餌料的前4 d,各個(gè)實(shí)驗(yàn)組鮑苗都大量死亡,尤其是前2 d,日死亡700~800 枚,累計(jì)死亡率直線上升。從第3 d 開始,各實(shí)驗(yàn)組鮑苗死亡量迅速下降,累計(jì)死亡率增加的速度放緩,但投喂菌劑各組鮑苗死亡率增加的速度比對(duì)照組更緩慢。飼育到第31 d 時(shí),A、B、C、D 和E 組鮑苗累計(jì)死亡率分別為(10.6±1.50)%、(8.55±1.01)%、(7.64±0.95)%、(7.14±1.43)%和(7.86±0.91)%。菌劑劑量越高,鮑苗累計(jì)死亡率越小,但各組間差異不顯著(P>0.05)。31 d 后,對(duì)照組鮑苗累計(jì)死亡率的變化比較平穩(wěn),但投放菌劑各組鮑苗死亡率開始升高,飼育到第56 d 時(shí),A、B、C、D 和E 組鮑苗累計(jì)死亡率分別為(14.69±1.58)%、(14.75±1.67)%、(14.58±1.10)%、(13.76±0.96)%和(14.61±1.29)%。各投放菌劑組鮑苗的累計(jì)死亡率與對(duì)照組已經(jīng)沒有明顯差別(圖1)。
圖1 餌料轉(zhuǎn)換后鮑苗累計(jì)死亡率Fig.1 The cumulative mortality of juvenile disk abalone exposed to food change
觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組飼育池排水管濾網(wǎng)不清爽,發(fā)粘,污水下落處水泥地面粘滑;投放菌劑各組出水管濾網(wǎng)較清爽,污水下落處水泥地面粘滑程度較輕,菌劑量越高,效果越好;相同劑量的菌苔和菌液組效果沒有明顯差別。
經(jīng)過56 d 飼育,添加中劑量復(fù)合菌苔組殼長(zhǎng)0.9 cm 以上鮑苗數(shù)量最多,達(dá)到(6.29±0.94)萬枚,比對(duì)照組高33.5%;添加低劑量復(fù)合菌苔組殼長(zhǎng)0.9 cm 以上鮑苗數(shù)量為(6.20±0.69)萬枚,比對(duì)照組高31.6%;但各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異均沒達(dá)到顯著水平(P>0.05)(表1)。
表1 各實(shí)驗(yàn)組殼長(zhǎng)達(dá)到0.9 cm 鮑苗數(shù)量Tab.1 The number of juvenile disk abalone with shell length of ≥0.9 cm in the experimental groups
實(shí)驗(yàn)在海水溫度降到23℃以下時(shí)進(jìn)行,投菌組與對(duì)照組鮑苗都沒有大量死亡。鮑苗累計(jì)死亡率曲線平緩上行,尤其在水溫下降到20℃以下時(shí),鮑苗死亡量漸次減少,鮑苗累計(jì)死亡率曲線更加平緩(圖2)。在該實(shí)驗(yàn)期內(nèi),投菌組與對(duì)照組鮑苗的死亡率基本一致。
圖2 高溫期過后時(shí)期實(shí)驗(yàn)池內(nèi)鮑苗累計(jì)死亡率Fig.2 The cumulative mortality of juvenile disk abalone in each group after high temperature period
投菌組鮑苗的死亡率、產(chǎn)量、殼長(zhǎng)和殼長(zhǎng)2.2 cm以上商品鮑苗數(shù)量均好于對(duì)照組,投菌組與對(duì)照組鮑苗產(chǎn)量和2.2 cm 以上商品鮑苗數(shù)量差異顯著(P<0.05)(表2)。
表2 高溫期過后時(shí)期菌劑對(duì)鮑苗的益生效果Tab.2 The effects of WA64 and WA65 on survival and growth of juvenile disk abalone after high temperature period
自Kozasa[18]利用土壤中分離的芽胞桿菌抵御愛德華氏弧菌(Edwardsiella tarda)、提高養(yǎng)殖日本鰻(Anguilla japonica)成活率以來,許多水生動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中都開始嘗試使用益生菌制劑。但是,目前水產(chǎn)益生菌制劑大多利用陸生動(dòng)物益生菌,有可能不適應(yīng)水生動(dòng)物的腸道環(huán)境,不能在腸道內(nèi)維持菌群的規(guī)模,應(yīng)用效果不理想[19]。研制高效、專一性水產(chǎn)微生態(tài)制劑是未來發(fā)展的主要趨勢(shì)之一[20]。姜海峰等[15]從皺紋盤鮑腸道中分離出對(duì)病原菌哈維弧菌和燦爛弧菌具有拮抗作用的希瓦氏菌W64 和W65,發(fā)現(xiàn)該菌劑能顯著提高皺紋盤鮑幼鮑在高溫期的存活率。本研究發(fā)現(xiàn),該菌劑可以有效促進(jìn)餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期后期皺紋盤鮑鮑苗的生長(zhǎng)。所以,專一性的希瓦氏菌WA64 與WA65 菌劑對(duì)各個(gè)階段食用人工餌料的皺紋盤鮑苗種都具有較好的益生作用。
Nikoskelainen 等[21]認(rèn)為,過高或過低的益生菌劑量均會(huì)影響益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生效果。本研究顯示,菌量109cfu/g 餌料組鮑苗的生長(zhǎng)效果反不如菌量為107cfu/g 和108cfu/g 餌料組,與Nikoskelainen 等[21]的結(jié)論相吻合。可能是添加太多的菌種會(huì)改變鮑苗腸道中的微生態(tài)結(jié)構(gòu),不利于鮑苗的生長(zhǎng)。餌料中添加菌苔的效果好于添加菌液,可能是菌液中含有鮑苗較敏感的物質(zhì),比如氨氮等,減低了益生菌的效用。
本研究中,益生菌制劑對(duì)初始食用人工餌料皺紋盤鮑幼鮑存活和生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)中,開始食用人工餌料的前四天,對(duì)照組鮑苗每日大量死亡,之后死亡量降低,然后趨于穩(wěn)定,這與苗種生產(chǎn)中的整體情況一致。但投喂菌劑的各組鮑苗日死亡量變化趨勢(shì)與對(duì)照組不同,前期鮑苗日死亡數(shù)量比對(duì)照組明顯減少,但日死亡量降低到一定程度后,有一個(gè)反彈過程,然后日死亡量又開始下降,之后趨于平穩(wěn)。原因可能是食用添加菌劑餌料的鮑苗迅速建立了腸道微生物群落,有效減弱了食物轉(zhuǎn)換而帶來的不良影響[22],有利于鮑苗度過餌料轉(zhuǎn)換的敏感期,但存活下來的體質(zhì)較差的鮑苗仍然不能適應(yīng)后續(xù)的生存選擇,后來仍然被淘汰掉。
益生菌制劑連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間使用,會(huì)造成不必要的浪費(fèi)[22]。而飼喂時(shí)間過短,益生菌在動(dòng)物腸道內(nèi)數(shù)量過少,不能發(fā)揮出有效作用[23]。Macey 和Coyne[24]在餌料中添加3 種益生菌(Vibrio midae SY9,Cryptococcus sp.SS1,Debaryomyces hansenii AY1),測(cè)定其在南非鮑腸道內(nèi)定植時(shí)間,得到最優(yōu)的投喂周期為2 d,而Lehata 等[8]發(fā)現(xiàn),片球菌Pediococcus sp.Ab1 在日本大盤鮑腸道中的定植周期為12 d。皺紋盤鮑益生菌制劑的適宜使用時(shí)間沒有基礎(chǔ)數(shù)據(jù),本研究中益生菌制劑的使用是連續(xù)進(jìn)行。皺紋盤鮑益生菌制劑的使用周期有待進(jìn)一步研究。