冷曉飛

（大連海寶漁業(yè)有限公司，遼寧 大連 116045）

皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino）是中國(guó)沿海重要的養(yǎng)殖珍品之一。野生資源減少和市場(chǎng)需求增加，皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino）作為重要海珍品的工廠化人工育苗迅速發(fā)展。隨著集約化程度的提高，皺紋盤鮑苗種生產(chǎn)中病害頻發(fā)，鮑苗大量死亡，造成很大經(jīng)濟(jì)損失[1,2]?？股厥欠乐尾『Φ膫鹘y(tǒng)藥物，但頻繁使用抗生素導(dǎo)致病原體產(chǎn)生耐藥性，加大了病害的防治難度；殘留于鮑體內(nèi)的抗生素對(duì)消費(fèi)人群的健康構(gòu)成了潛在威脅，限制了出口貿(mào)易[3]。因此皺紋盤鮑苗種生產(chǎn)中急需更好更有效的方法防治病害。

益生菌能抑制有害菌的生長(zhǎng)、提供營(yíng)養(yǎng)成分且能強(qiáng)化動(dòng)物腸道黏膜屏障等[4,5]。近些年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的研究逐漸深入，益生菌對(duì)鮑益生作用的相關(guān)研究也有持續(xù)的報(bào)道。Macey 等[6]在餌料中添加弧菌和兩株酵母菌顯著提高了南非中間鮑Haliotis midae 生長(zhǎng)及抗病力。Doeschate 和Coyne[7]用南非中間鮑腸道內(nèi)的交替假單胞菌Pseudoalteromonas tetraodonis 制劑顯著提高了該鮑的生長(zhǎng)。Lehata 等[8]發(fā)現(xiàn)，由腸道分離的片球菌Pediococcus sp.Ab1 很好地促進(jìn)了日本大盤鮑Haliotis gigantea（madake）的生長(zhǎng)。蔣慶茹等[9]分離和鑒定了雜色鮑Haliotis diversicolor 腸道益生菌。蛭弧菌Vibrio bdello 制劑有利于九孔鮑Haliotis diversicolor aquatilis 的生長(zhǎng)和存活[10]。楊寶麗[11]研究了皺紋盤鮑養(yǎng)殖水體及其消化道中細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化特征。劉麗等[12]發(fā)現(xiàn)，紅假單胞菌Rhodopseudomonas sp.和枯草芽孢桿菌Bacillus Subtilis（Ehrenberg）Cohn 的混合菌液可提高皺紋盤鮑的免疫力，促進(jìn)皺紋盤鮑生長(zhǎng)。郭衍彪等[13]發(fā)現(xiàn)蛭弧菌對(duì)皺紋盤鮑腸道微生態(tài)具有積極影響。冷曉飛等[14]分析了皺紋盤鮑腸道菌群的結(jié)構(gòu)。姜海峰等[15,16]從皺紋盤鮑腸道中篩選出5 種潛在益生菌，其中希瓦氏菌Shewanella sp.（WA64）和Shewanella sp.（WA65）對(duì)鮑魚病原菌燦爛弧菌Vibrio splendidus 和哈維弧菌Vibrio harveyi 具有較好拮抗效果。凌宇恒等[17]研究了鮑腸道益生菌芽孢桿菌Bacillus stratosphericus 的培養(yǎng)條件。益生菌制劑具有環(huán)保綠色的特點(diǎn)，研發(fā)益生菌制劑為解決鮑苗病害和藥殘問題帶來了新思路。

底棲硅藻餌料到人工餌料轉(zhuǎn)換期、高溫期和高溫期過后（水溫降至23℃以下）期是影響皺紋盤鮑苗成活率和生長(zhǎng)率的關(guān)鍵時(shí)期。本課題組曾在人工餌料中添加希瓦氏菌（WA64 和WA65）制劑，有效降低了高溫期鮑苗的死亡量[15]。但希瓦氏菌對(duì)餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期過后皺紋盤鮑幼鮑生長(zhǎng)和存活的影響尚無研究。

本研究在餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期過后時(shí)期，將希瓦氏菌WA64 和WA65 添加到人工餌料中飼喂幼鮑，探討益生菌復(fù)合制劑對(duì)這兩個(gè)時(shí)期幼鮑生長(zhǎng)和存活的影響，為鮑的人工育苗提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中用皺紋盤鮑幼鮑來自大連海寶漁業(yè)有限公司育苗場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)用希瓦氏菌菌株WA64 和WA65 來源于大連海寶漁業(yè)有限公司遼寧省工程技術(shù)研究中心。

菌液培養(yǎng)：用接種環(huán)取斜面保藏的WA64 和WA65 菌種，分別在2216E 瓊脂（瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%）培養(yǎng)基平板上劃線，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑單菌落，無菌條件下轉(zhuǎn)移到10 mL 海洋2216E 液體培養(yǎng)基中，搖床（140 r/min，28℃）培養(yǎng)16 h。獲得的種子菌液，再在無菌條件下轉(zhuǎn)移到300 mL 或3 000 mL（依實(shí)驗(yàn)需求量確定）海洋2216E 液體培養(yǎng)基中，搖床（140 r/min，28℃）培養(yǎng)48 h，獲得WA64 和WA65菌液，定量后，放到冷藏柜中，在4℃條件下保藏待用。

菌苔培養(yǎng)：用2216E 瓊脂（瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%）培養(yǎng)基倒大平板（培養(yǎng)皿直徑18 cm），用涂布棒將1 mL WA64（或WA65）種子菌液在大平板培養(yǎng)基表面涂均勻，在恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h 后，于超凈臺(tái)內(nèi)加入10 mL 滅菌海水，用涂布棒刮取菌苔，轉(zhuǎn)移到燒杯中，用血球計(jì)數(shù)板定量后冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 餌料轉(zhuǎn)換期實(shí)驗(yàn)

15 個(gè)長(zhǎng)8 m×寬1.3 m 培育池分成A、B、C、D和E 5 組，每組3 個(gè)重復(fù)。每個(gè)培育池投放從底棲硅藻板上剝離下來的殼長(zhǎng)（0.35±0.09）cm（n=100）皺紋盤鮑幼鮑8 萬枚，水溫（17±2）℃，日流水量為4倍飼育水體，每日投餌一次。A 組投喂正常人工餌料，B、C 和D 組分別投喂添加低（107cells/g 餌料）、中（108cells/g 餌料）和高（109cells/g 餌料）劑量復(fù)合菌苔制劑（WA64 和WA65）的餌料。E 組投喂添加中劑量（108cells/g 餌料）復(fù)合菌液制劑餌料。菌劑在投餌前半小時(shí)拌入餌料中。每日清理、計(jì)數(shù)各實(shí)驗(yàn)池死亡鮑苗，觀察各個(gè)實(shí)驗(yàn)池排水管濾網(wǎng)上殘餌和粘稠情況、排水管廢水下落處水泥地面粘滑情況。飼養(yǎng)56 d 時(shí)鮑苗分苗培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)各池中殼長(zhǎng)0.9 cm以上的幼鮑數(shù)量。

1.2.2 高溫期過后時(shí)期實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用10 個(gè)皺紋盤鮑苗種培育池，規(guī)格、形態(tài)同1.2.1，依次編號(hào)1～10 號(hào)。每個(gè)培育池投放殼長(zhǎng)（2.13±0.22）cm（n=100）、體質(zhì)量1.24 g 皺紋盤鮑幼鮑26.2 kg，其中1、3、5、7、9 號(hào)池投喂正常人工餌料，作為對(duì)照組；2、4、6、8、10 號(hào)池投喂添加菌苔制劑人工餌料（WA64 和WA65 濃度為108cells/g 餌料），作為處理組。實(shí)驗(yàn)水溫15.8～23.2℃，日流水量為3～5 倍飼育水體，每日投餌一次。每日清理各池死亡鮑苗數(shù)。飼養(yǎng)67 d 時(shí)，統(tǒng)計(jì)各池中鮑苗的產(chǎn)量（重量）、數(shù)量、殼長(zhǎng)2.2 cm 以上商品苗種數(shù)量，鮑苗的殼長(zhǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用spss17.0 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌制劑對(duì)餌料轉(zhuǎn)換初期鮑苗存活和生長(zhǎng)影響

攝食人工餌料的前4 d，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組鮑苗都大量死亡，尤其是前2 d，日死亡700～800 枚，累計(jì)死亡率直線上升。從第3 d 開始，各實(shí)驗(yàn)組鮑苗死亡量迅速下降，累計(jì)死亡率增加的速度放緩，但投喂菌劑各組鮑苗死亡率增加的速度比對(duì)照組更緩慢。飼育到第31 d 時(shí)，A、B、C、D 和E 組鮑苗累計(jì)死亡率分別為（10.6±1.50）%、（8.55±1.01）%、（7.64±0.95）%、（7.14±1.43）%和（7.86±0.91）%。菌劑劑量越高，鮑苗累計(jì)死亡率越小，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。31 d 后，對(duì)照組鮑苗累計(jì)死亡率的變化比較平穩(wěn)，但投放菌劑各組鮑苗死亡率開始升高，飼育到第56 d 時(shí)，A、B、C、D 和E 組鮑苗累計(jì)死亡率分別為（14.69±1.58）%、（14.75±1.67）%、（14.58±1.10）%、（13.76±0.96）%和（14.61±1.29）%。各投放菌劑組鮑苗的累計(jì)死亡率與對(duì)照組已經(jīng)沒有明顯差別（圖1）。

圖1 餌料轉(zhuǎn)換后鮑苗累計(jì)死亡率Fig.1 The cumulative mortality of juvenile disk abalone exposed to food change

觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組飼育池排水管濾網(wǎng)不清爽，發(fā)粘，污水下落處水泥地面粘滑；投放菌劑各組出水管濾網(wǎng)較清爽，污水下落處水泥地面粘滑程度較輕，菌劑量越高，效果越好；相同劑量的菌苔和菌液組效果沒有明顯差別。

經(jīng)過56 d 飼育，添加中劑量復(fù)合菌苔組殼長(zhǎng)0.9 cm 以上鮑苗數(shù)量最多，達(dá)到（6.29±0.94）萬枚，比對(duì)照組高33.5%；添加低劑量復(fù)合菌苔組殼長(zhǎng)0.9 cm 以上鮑苗數(shù)量為（6.20±0.69）萬枚，比對(duì)照組高31.6%；但各個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異均沒達(dá)到顯著水平（P>0.05）（表1）。

表1 各實(shí)驗(yàn)組殼長(zhǎng)達(dá)到0.9 cm 鮑苗數(shù)量Tab.1 The number of juvenile disk abalone with shell length of ≥0.9 cm in the experimental groups

2.2 益生菌制劑對(duì)高溫期過后時(shí)期鮑苗生長(zhǎng)和存活影響

實(shí)驗(yàn)在海水溫度降到23℃以下時(shí)進(jìn)行，投菌組與對(duì)照組鮑苗都沒有大量死亡。鮑苗累計(jì)死亡率曲線平緩上行，尤其在水溫下降到20℃以下時(shí)，鮑苗死亡量漸次減少，鮑苗累計(jì)死亡率曲線更加平緩（圖2）。在該實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，投菌組與對(duì)照組鮑苗的死亡率基本一致。

圖2 高溫期過后時(shí)期實(shí)驗(yàn)池內(nèi)鮑苗累計(jì)死亡率Fig.2 The cumulative mortality of juvenile disk abalone in each group after high temperature period

投菌組鮑苗的死亡率、產(chǎn)量、殼長(zhǎng)和殼長(zhǎng)2.2 cm以上商品鮑苗數(shù)量均好于對(duì)照組，投菌組與對(duì)照組鮑苗產(chǎn)量和2.2 cm 以上商品鮑苗數(shù)量差異顯著（P<0.05）（表2）。

表2 高溫期過后時(shí)期菌劑對(duì)鮑苗的益生效果Tab.2 The effects of WA64 and WA65 on survival and growth of juvenile disk abalone after high temperature period

3 討論

自Kozasa[18]利用土壤中分離的芽胞桿菌抵御愛德華氏弧菌（Edwardsiella tarda）、提高養(yǎng)殖日本鰻（Anguilla japonica）成活率以來，許多水生動(dòng)物養(yǎng)殖生產(chǎn)中都開始嘗試使用益生菌制劑。但是，目前水產(chǎn)益生菌制劑大多利用陸生動(dòng)物益生菌，有可能不適應(yīng)水生動(dòng)物的腸道環(huán)境，不能在腸道內(nèi)維持菌群的規(guī)模，應(yīng)用效果不理想[19]。研制高效、專一性水產(chǎn)微生態(tài)制劑是未來發(fā)展的主要趨勢(shì)之一[20]。姜海峰等[15]從皺紋盤鮑腸道中分離出對(duì)病原菌哈維弧菌和燦爛弧菌具有拮抗作用的希瓦氏菌W64 和W65，發(fā)現(xiàn)該菌劑能顯著提高皺紋盤鮑幼鮑在高溫期的存活率。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌劑可以有效促進(jìn)餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期后期皺紋盤鮑鮑苗的生長(zhǎng)。所以，專一性的希瓦氏菌WA64 與WA65 菌劑對(duì)各個(gè)階段食用人工餌料的皺紋盤鮑苗種都具有較好的益生作用。

Nikoskelainen 等[21]認(rèn)為，過高或過低的益生菌劑量均會(huì)影響益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生效果。本研究顯示，菌量109cfu/g 餌料組鮑苗的生長(zhǎng)效果反不如菌量為107cfu/g 和108cfu/g 餌料組，與Nikoskelainen 等[21]的結(jié)論相吻合。可能是添加太多的菌種會(huì)改變鮑苗腸道中的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，不利于鮑苗的生長(zhǎng)。餌料中添加菌苔的效果好于添加菌液，可能是菌液中含有鮑苗較敏感的物質(zhì)，比如氨氮等，減低了益生菌的效用。

本研究中，益生菌制劑對(duì)初始食用人工餌料皺紋盤鮑幼鮑存活和生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)中，開始食用人工餌料的前四天，對(duì)照組鮑苗每日大量死亡，之后死亡量降低，然后趨于穩(wěn)定，這與苗種生產(chǎn)中的整體情況一致。但投喂菌劑的各組鮑苗日死亡量變化趨勢(shì)與對(duì)照組不同，前期鮑苗日死亡數(shù)量比對(duì)照組明顯減少，但日死亡量降低到一定程度后，有一個(gè)反彈過程，然后日死亡量又開始下降，之后趨于平穩(wěn)。原因可能是食用添加菌劑餌料的鮑苗迅速建立了腸道微生物群落，有效減弱了食物轉(zhuǎn)換而帶來的不良影響[22]，有利于鮑苗度過餌料轉(zhuǎn)換的敏感期，但存活下來的體質(zhì)較差的鮑苗仍然不能適應(yīng)后續(xù)的生存選擇，后來仍然被淘汰掉。

益生菌制劑連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間使用，會(huì)造成不必要的浪費(fèi)[22]。而飼喂時(shí)間過短，益生菌在動(dòng)物腸道內(nèi)數(shù)量過少，不能發(fā)揮出有效作用[23]。Macey 和Coyne[24]在餌料中添加3 種益生菌（Vibrio midae SY9,Cryptococcus sp.SS1，Debaryomyces hansenii AY1），測(cè)定其在南非鮑腸道內(nèi)定植時(shí)間，得到最優(yōu)的投喂周期為2 d，而Lehata 等[8]發(fā)現(xiàn)，片球菌Pediococcus sp.Ab1 在日本大盤鮑腸道中的定植周期為12 d。皺紋盤鮑益生菌制劑的適宜使用時(shí)間沒有基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本研究中益生菌制劑的使用是連續(xù)進(jìn)行。皺紋盤鮑益生菌制劑的使用周期有待進(jìn)一步研究。