冷曉飛

（大連海寶漁業(yè)有限公司，遼寧 大連 116045）

皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino）是中國沿海重要的養(yǎng)殖珍品之一。野生資源減少和市場需求增加，皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai Ino）作為重要海珍品的工廠化人工育苗迅速發(fā)展。隨著集約化程度的提高，皺紋盤鮑苗種生產(chǎn)中病害頻發(fā)，鮑苗大量死亡，造成很大經(jīng)濟損失[1,2]。抗生素是防治病害的傳統(tǒng)藥物，但頻繁使用抗生素導(dǎo)致病原體產(chǎn)生耐藥性，加大了病害的防治難度；殘留于鮑體內(nèi)的抗生素對消費人群的健康構(gòu)成了潛在威脅，限制了出口貿(mào)易[3]。因此皺紋盤鮑苗種生產(chǎn)中急需更好更有效的方法防治病害。

益生菌能抑制有害菌的生長、提供營養(yǎng)成分且能強化動物腸道黏膜屏障等[4,5]。近些年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的研究逐漸深入，益生菌對鮑益生作用的相關(guān)研究也有持續(xù)的報道。Macey 等[6]在餌料中添加弧菌和兩株酵母菌顯著提高了南非中間鮑Haliotis midae 生長及抗病力。Doeschate 和Coyne[7]用南非中間鮑腸道內(nèi)的交替假單胞菌Pseudoalteromonas tetraodonis 制劑顯著提高了該鮑的生長。Lehata 等[8]發(fā)現(xiàn)，由腸道分離的片球菌Pediococcus sp.Ab1 很好地促進了日本大盤鮑Haliotis gigantea（madake）的生長。蔣慶茹等[9]分離和鑒定了雜色鮑Haliotis diversicolor 腸道益生菌。蛭弧菌Vibrio bdello 制劑有利于九孔鮑Haliotis diversicolor aquatilis 的生長和存活[10]。楊寶麗[11]研究了皺紋盤鮑養(yǎng)殖水體及其消化道中細菌動態(tài)變化特征。劉麗等[12]發(fā)現(xiàn)，紅假單胞菌Rhodopseudomonas sp.和枯草芽孢桿菌Bacillus Subtilis（Ehrenberg）Cohn 的混合菌液可提高皺紋盤鮑的免疫力，促進皺紋盤鮑生長。郭衍彪等[13]發(fā)現(xiàn)蛭弧菌對皺紋盤鮑腸道微生態(tài)具有積極影響。冷曉飛等[14]分析了皺紋盤鮑腸道菌群的結(jié)構(gòu)。姜海峰等[15,16]從皺紋盤鮑腸道中篩選出5 種潛在益生菌，其中希瓦氏菌Shewanella sp.（WA64）和Shewanella sp.（WA65）對鮑魚病原菌燦爛弧菌Vibrio splendidus 和哈維弧菌Vibrio harveyi 具有較好拮抗效果。凌宇恒等[17]研究了鮑腸道益生菌芽孢桿菌Bacillus stratosphericus 的培養(yǎng)條件。益生菌制劑具有環(huán)保綠色的特點，研發(fā)益生菌制劑為解決鮑苗病害和藥殘問題帶來了新思路。

底棲硅藻餌料到人工餌料轉(zhuǎn)換期、高溫期和高溫期過后（水溫降至23℃以下）期是影響皺紋盤鮑苗成活率和生長率的關(guān)鍵時期。本課題組曾在人工餌料中添加希瓦氏菌（WA64 和WA65）制劑，有效降低了高溫期鮑苗的死亡量[15]。但希瓦氏菌對餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期過后皺紋盤鮑幼鮑生長和存活的影響尚無研究。

本研究在餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期過后時期，將希瓦氏菌WA64 和WA65 添加到人工餌料中飼喂幼鮑，探討益生菌復(fù)合制劑對這兩個時期幼鮑生長和存活的影響，為鮑的人工育苗提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中用皺紋盤鮑幼鮑來自大連海寶漁業(yè)有限公司育苗場。實驗用希瓦氏菌菌株WA64 和WA65 來源于大連海寶漁業(yè)有限公司遼寧省工程技術(shù)研究中心。

菌液培養(yǎng)：用接種環(huán)取斜面保藏的WA64 和WA65 菌種，分別在2216E 瓊脂（瓊脂質(zhì)量分數(shù)1.7%）培養(yǎng)基平板上劃線，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑單菌落，無菌條件下轉(zhuǎn)移到10 mL 海洋2216E 液體培養(yǎng)基中，搖床（140 r/min，28℃）培養(yǎng)16 h。獲得的種子菌液，再在無菌條件下轉(zhuǎn)移到300 mL 或3 000 mL（依實驗需求量確定）海洋2216E 液體培養(yǎng)基中，搖床（140 r/min，28℃）培養(yǎng)48 h，獲得WA64 和WA65菌液，定量后，放到冷藏柜中，在4℃條件下保藏待用。

菌苔培養(yǎng)：用2216E 瓊脂（瓊脂質(zhì)量分數(shù)1.7%）培養(yǎng)基倒大平板（培養(yǎng)皿直徑18 cm），用涂布棒將1 mL WA64（或WA65）種子菌液在大平板培養(yǎng)基表面涂均勻，在恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h 后，于超凈臺內(nèi)加入10 mL 滅菌海水，用涂布棒刮取菌苔，轉(zhuǎn)移到燒杯中，用血球計數(shù)板定量后冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 餌料轉(zhuǎn)換期實驗

15 個長8 m×寬1.3 m 培育池分成A、B、C、D和E 5 組，每組3 個重復(fù)。每個培育池投放從底棲硅藻板上剝離下來的殼長（0.35±0.09）cm（n=100）皺紋盤鮑幼鮑8 萬枚，水溫（17±2）℃，日流水量為4倍飼育水體，每日投餌一次。A 組投喂正常人工餌料，B、C 和D 組分別投喂添加低（107cells/g 餌料）、中（108cells/g 餌料）和高（109cells/g 餌料）劑量復(fù)合菌苔制劑（WA64 和WA65）的餌料。E 組投喂添加中劑量（108cells/g 餌料）復(fù)合菌液制劑餌料。菌劑在投餌前半小時拌入餌料中。每日清理、計數(shù)各實驗池死亡鮑苗，觀察各個實驗池排水管濾網(wǎng)上殘餌和粘稠情況、排水管廢水下落處水泥地面粘滑情況。飼養(yǎng)56 d 時鮑苗分苗培養(yǎng)，統(tǒng)計各池中殼長0.9 cm以上的幼鮑數(shù)量。

1.2.2 高溫期過后時期實驗

實驗用10 個皺紋盤鮑苗種培育池，規(guī)格、形態(tài)同1.2.1，依次編號1～10 號。每個培育池投放殼長（2.13±0.22）cm（n=100）、體質(zhì)量1.24 g 皺紋盤鮑幼鮑26.2 kg，其中1、3、5、7、9 號池投喂正常人工餌料，作為對照組；2、4、6、8、10 號池投喂添加菌苔制劑人工餌料（WA64 和WA65 濃度為108cells/g 餌料），作為處理組。實驗水溫15.8～23.2℃，日流水量為3～5 倍飼育水體，每日投餌一次。每日清理各池死亡鮑苗數(shù)。飼養(yǎng)67 d 時，統(tǒng)計各池中鮑苗的產(chǎn)量（重量）、數(shù)量、殼長2.2 cm 以上商品苗種數(shù)量，鮑苗的殼長。

1.3 統(tǒng)計分析方法

實驗結(jié)果采用spss17.0 軟件進行t 檢驗分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌制劑對餌料轉(zhuǎn)換初期鮑苗存活和生長影響

攝食人工餌料的前4 d，各個實驗組鮑苗都大量死亡，尤其是前2 d，日死亡700～800 枚，累計死亡率直線上升。從第3 d 開始，各實驗組鮑苗死亡量迅速下降，累計死亡率增加的速度放緩，但投喂菌劑各組鮑苗死亡率增加的速度比對照組更緩慢。飼育到第31 d 時，A、B、C、D 和E 組鮑苗累計死亡率分別為（10.6±1.50）%、（8.55±1.01）%、（7.64±0.95）%、（7.14±1.43）%和（7.86±0.91）%。菌劑劑量越高，鮑苗累計死亡率越小，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。31 d 后，對照組鮑苗累計死亡率的變化比較平穩(wěn)，但投放菌劑各組鮑苗死亡率開始升高，飼育到第56 d 時，A、B、C、D 和E 組鮑苗累計死亡率分別為（14.69±1.58）%、（14.75±1.67）%、（14.58±1.10）%、（13.76±0.96）%和（14.61±1.29）%。各投放菌劑組鮑苗的累計死亡率與對照組已經(jīng)沒有明顯差別（圖1）。

圖1 餌料轉(zhuǎn)換后鮑苗累計死亡率Fig.1 The cumulative mortality of juvenile disk abalone exposed to food change

觀察發(fā)現(xiàn)，對照組飼育池排水管濾網(wǎng)不清爽，發(fā)粘，污水下落處水泥地面粘滑；投放菌劑各組出水管濾網(wǎng)較清爽，污水下落處水泥地面粘滑程度較輕，菌劑量越高，效果越好；相同劑量的菌苔和菌液組效果沒有明顯差別。

經(jīng)過56 d 飼育，添加中劑量復(fù)合菌苔組殼長0.9 cm 以上鮑苗數(shù)量最多，達到（6.29±0.94）萬枚，比對照組高33.5%；添加低劑量復(fù)合菌苔組殼長0.9 cm 以上鮑苗數(shù)量為（6.20±0.69）萬枚，比對照組高31.6%；但各個實驗組之間差異均沒達到顯著水平（P>0.05）（表1）。

表1 各實驗組殼長達到0.9 cm 鮑苗數(shù)量Tab.1 The number of juvenile disk abalone with shell length of ≥0.9 cm in the experimental groups

2.2 益生菌制劑對高溫期過后時期鮑苗生長和存活影響

實驗在海水溫度降到23℃以下時進行，投菌組與對照組鮑苗都沒有大量死亡。鮑苗累計死亡率曲線平緩上行，尤其在水溫下降到20℃以下時，鮑苗死亡量漸次減少，鮑苗累計死亡率曲線更加平緩（圖2）。在該實驗期內(nèi)，投菌組與對照組鮑苗的死亡率基本一致。

圖2 高溫期過后時期實驗池內(nèi)鮑苗累計死亡率Fig.2 The cumulative mortality of juvenile disk abalone in each group after high temperature period

投菌組鮑苗的死亡率、產(chǎn)量、殼長和殼長2.2 cm以上商品鮑苗數(shù)量均好于對照組，投菌組與對照組鮑苗產(chǎn)量和2.2 cm 以上商品鮑苗數(shù)量差異顯著（P<0.05）（表2）。

表2 高溫期過后時期菌劑對鮑苗的益生效果Tab.2 The effects of WA64 and WA65 on survival and growth of juvenile disk abalone after high temperature period

3 討論

自Kozasa[18]利用土壤中分離的芽胞桿菌抵御愛德華氏弧菌（Edwardsiella tarda）、提高養(yǎng)殖日本鰻（Anguilla japonica）成活率以來，許多水生動物養(yǎng)殖生產(chǎn)中都開始嘗試使用益生菌制劑。但是，目前水產(chǎn)益生菌制劑大多利用陸生動物益生菌，有可能不適應(yīng)水生動物的腸道環(huán)境，不能在腸道內(nèi)維持菌群的規(guī)模，應(yīng)用效果不理想[19]。研制高效、專一性水產(chǎn)微生態(tài)制劑是未來發(fā)展的主要趨勢之一[20]。姜海峰等[15]從皺紋盤鮑腸道中分離出對病原菌哈維弧菌和燦爛弧菌具有拮抗作用的希瓦氏菌W64 和W65，發(fā)現(xiàn)該菌劑能顯著提高皺紋盤鮑幼鮑在高溫期的存活率。本研究發(fā)現(xiàn)，該菌劑可以有效促進餌料轉(zhuǎn)換期和高溫期后期皺紋盤鮑鮑苗的生長。所以，專一性的希瓦氏菌WA64 與WA65 菌劑對各個階段食用人工餌料的皺紋盤鮑苗種都具有較好的益生作用。

Nikoskelainen 等[21]認為，過高或過低的益生菌劑量均會影響益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生效果。本研究顯示，菌量109cfu/g 餌料組鮑苗的生長效果反不如菌量為107cfu/g 和108cfu/g 餌料組，與Nikoskelainen 等[21]的結(jié)論相吻合?？赡苁翘砑犹嗟木N會改變鮑苗腸道中的微生態(tài)結(jié)構(gòu)，不利于鮑苗的生長。餌料中添加菌苔的效果好于添加菌液，可能是菌液中含有鮑苗較敏感的物質(zhì)，比如氨氮等，減低了益生菌的效用。

本研究中，益生菌制劑對初始食用人工餌料皺紋盤鮑幼鮑存活和生長影響實驗中，開始食用人工餌料的前四天，對照組鮑苗每日大量死亡，之后死亡量降低，然后趨于穩(wěn)定，這與苗種生產(chǎn)中的整體情況一致。但投喂菌劑的各組鮑苗日死亡量變化趨勢與對照組不同，前期鮑苗日死亡數(shù)量比對照組明顯減少，但日死亡量降低到一定程度后，有一個反彈過程，然后日死亡量又開始下降，之后趨于平穩(wěn)。原因可能是食用添加菌劑餌料的鮑苗迅速建立了腸道微生物群落，有效減弱了食物轉(zhuǎn)換而帶來的不良影響[22]，有利于鮑苗度過餌料轉(zhuǎn)換的敏感期，但存活下來的體質(zhì)較差的鮑苗仍然不能適應(yīng)后續(xù)的生存選擇，后來仍然被淘汰掉。

益生菌制劑連續(xù)長時間使用，會造成不必要的浪費[22]。而飼喂時間過短，益生菌在動物腸道內(nèi)數(shù)量過少，不能發(fā)揮出有效作用[23]。Macey 和Coyne[24]在餌料中添加3 種益生菌（Vibrio midae SY9,Cryptococcus sp.SS1，Debaryomyces hansenii AY1），測定其在南非鮑腸道內(nèi)定植時間，得到最優(yōu)的投喂周期為2 d，而Lehata 等[8]發(fā)現(xiàn)，片球菌Pediococcus sp.Ab1 在日本大盤鮑腸道中的定植周期為12 d。皺紋盤鮑益生菌制劑的適宜使用時間沒有基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本研究中益生菌制劑的使用是連續(xù)進行。皺紋盤鮑益生菌制劑的使用周期有待進一步研究。