李 琳

（河北通標(biāo)檢測(cè)技術(shù)有限公司，河北石家莊 050000）

隨著社會(huì)的發(fā)展，食品中重金屬超標(biāo)、農(nóng)藥、獸藥和激素殘留及帶有致病菌等問(wèn)題已引起人們的廣泛關(guān)注。其中，獸藥殘留問(wèn)題較為嚴(yán)重[1]。隨著抗生素的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，且用量較大，帶來(lái)嚴(yán)重的獸藥殘留問(wèn)題。近年來(lái)，磺胺類藥物殘留超標(biāo)現(xiàn)象較嚴(yán)重，主要發(fā)生在豬肉、牛肉中。目前，磺胺類殘留的檢測(cè)方法較多，但這些方法對(duì)檢測(cè)儀器要求較高，且價(jià)格昂貴，適用范圍受到局限[2]。因此，建立一種方便快捷、適用性廣、靈敏度高及檢出限低的方法很有必要。本文通過(guò)基體固相擴(kuò)散（Matrix Solid-phase Dispersion，MSPD）和固相萃?。⊿olid-Phase Extraction，SPE）的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，用FMOC-Cl衍生，通過(guò)高效液相色譜-紫外法（High Performance Liquid Chromatography-ultraviolet Detection，HPLC-UV）同時(shí)檢測(cè)多種脂溶性和水溶性的磺胺類獸藥殘留。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

二氯甲烷；三氯甲烷；乙酸乙酯；正己烷；甲醇；無(wú)水乙醇；無(wú)水醋酸鈉；冰醋酸；衍生試劑；硅膠；固定相C18（Celite545）；蜂蜜，包括荊花蜜（野生）、油菜花蜜（野生）、紫云英蜜（汪氏）、萬(wàn)花蜜（汪氏）和荊花蜜（百花牌）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀；色譜工作臺(tái)；檢測(cè)器（UV，Waters 2487 Dual）；色譜柱（Inersil DDS-3）；氮?dú)獯蹈裳b置；可控水浴裝置；電子精密天平；101A-1型干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。稱取標(biāo)準(zhǔn)品磺胺吡啶（Sulphapyridine，SP）、磺胺嘧啶（Sulphadiazine，SD）、磺胺二甲嘧啶（Sulphamethazine，SM2）、磺 胺 甲 嘧 啶（Sulphamerazine，SDM）、 磺 胺 -6-甲 氧 嘧 啶（Sulphamonomethoxine，SMM）、 磺胺 -5-甲 氧 嘧 啶（Sulphameter，SME）、 磺 胺 氯噠嗪（Sulphachloropyridazine，SCP）和磺胺甲惡唑（Sulphamethoxazole，SMZ）各 10.00 mg溶于 10 mL甲醇中，得到l mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液Ⅰ。量取標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液Ⅰ 100 μL，定容至10 mL，得到10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液Ⅱ。量取標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液Ⅱ l mL，定容至5 mL，得到2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液Ⅲ。

（2）FMOC-C1衍生試劑配制。稱取157.9 mg FMOC-Cl用3 mL乙腈稀釋，得到0.20 mol/L衍生試劑Ⅰ。量取250 μL衍生試劑Ⅰ，定容至1 mL，得到0.05 mol/L衍生試劑Ⅱ。

（3）流動(dòng)相緩沖液的配制。稱取0.820 3 g無(wú)水醋酸鈉溶于1 000 mL水中，用醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.20。

（4）硼酸緩沖液的配制。稱取1.236 3 g硼酸溶于10 mL水中配成0.2 mol/L硼酸溶液，用飽和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0。

1.2.2 樣品預(yù)處理

用基體固相擴(kuò)散法凈化樣品。稱取1.0 g蜂蜜與3.0 g C18混合后加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液Ⅲ，在研缽中磨勻，晾干，裝柱。C18柱用15 mL正己烷淋洗，棄去淋洗液，用10 mL乙酸乙酯洗脫，收集并吹干洗脫液。

1.2.3 衍生化反應(yīng)

洗脫液吹干后，加入 100 μL 甲醇和 100 μL（pH=8.0）衍生試劑FMOC-C（l0.05 mol/L），充分振蕩，25 ℃條件下反應(yīng) 420 min。

1.2.4 SPE凈化

衍生完畢，用氮?dú)獯蹈啥嘤嗟脑噭?，? mL二氯甲烷溶解后充分振蕩。取1.0 g硅膠表柱后，依次用10 mL甲醇，10 mL一氯甲烷活化[3]。將振蕩后的樣品加入活化后的硅膠柱后依次用10 mL 二氯甲烷、10 mL氯仿淋洗；用8 mL含25%甲醇（體積百分含量）的二氯甲烷溶液洗脫，收集并吹干洗脫液，用400 μL流動(dòng)相溶解，過(guò)濾，待上機(jī)分析。

1.2.5 儀器條件

紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為263 nm；色譜條件：色譜柱為Inersil ODS 3，選擇流動(dòng)相A為NaOAc-HOAc緩沖體系，pH=4.20；流動(dòng)相B為乙腈；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；二元梯度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 多組分分離的色譜條件

根據(jù)待測(cè)樣品的衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)信息和紫外光譜特征，同時(shí)考慮到多種化合物同時(shí)檢測(cè)，選擇紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為263 nm[4]。高效液相色譜的二元流動(dòng)相A為pH=4.20的NaOAc-HOAc緩沖體系，B為乙腈，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。在試驗(yàn)多種流動(dòng)相比例后，初步確定流動(dòng)相A（醋酸緩沖液）∶B（乙腈）為45∶55（V/V），在此比例下，分離效果較好。但因?qū)嶒?yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，為縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間采用二元流動(dòng)相梯度洗脫，對(duì)9種磺胺類藥物的FMOC-衍生物進(jìn)行分離，見(jiàn)表1。

表1 高效液相色譜二元梯度洗脫條件

圖1是標(biāo)準(zhǔn)樣品混合溶液經(jīng)衍生后的液相色譜分離譜圖，9種藥物在26 min內(nèi)全部出峰，且分離度良好。但衍生試劑的水解峰（FMOC-OH）較明顯，待測(cè)樣品濃度較低時(shí)可能會(huì)造成干擾，需要考慮去除。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜分離譜圖（各組分濃度均為200 μg/L）

2.2 基體固相擴(kuò)散對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行凈化條件的優(yōu)化

將樣品磨碎后與固定相在物理上混合均勻，使樣品中的待分析組分不經(jīng)過(guò)任何提取操作就可以完全地、均勻地結(jié)合在固定相的表面，可大大簡(jiǎn)化分析步驟、縮短分析時(shí)間[5]。根據(jù)不同組分與固定相的結(jié)合力的種類及大小的不同，選用不同的溶劑對(duì)固定相進(jìn)行淋洗，即可將不同的組分逐一洗脫出來(lái)。

分別用正己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和甲醇對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)正己烷能將雜質(zhì)洗脫但不會(huì)將分析物洗脫；二氯甲烷和氯仿能將雜質(zhì)洗脫并能將部分分析物洗脫；乙酸乙酯可將大部分分析物洗脫且洗脫的雜質(zhì)較少，甲醇能將分析物和雜質(zhì)都洗脫下來(lái)。淋洗的主要目的是將雜質(zhì)洗掉，但要保證分析物保留在柱子里，盡量減少分析物的損失。因此，最終選擇正己烷作為淋洗液。選擇洗脫液的基本條件是將分析物盡可能的洗脫下來(lái)，使雜質(zhì)仍保留在柱中。因此，選擇乙酸乙酯作為洗脫液。

2.3 檢出限

將磺胺類藥品各組分含量為100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋為 4 μg/L、5 μg/L、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、25 μg/L和50 μg/L，經(jīng)衍生反應(yīng)、SPE凈化后進(jìn)行測(cè)定。加標(biāo)量為4～6 μg/L時(shí)，由于雜質(zhì)峰的干擾，對(duì)峰面積的準(zhǔn)確積分造成了影響。因此，該方法測(cè)定蜂蜜中9種磺胺類藥物殘留的檢出限為4～6 μg/kg。

2.4 加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)

選取荊花蜜（野生）作為樣本，設(shè)置10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 和 250 μg/kg 5 個(gè)加標(biāo)量。按照優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件，稱取1.0 g荊花蜜（野生），分別加入不同量標(biāo)準(zhǔn)樣品后經(jīng)基體固相擴(kuò)散，衍生化反應(yīng)，SPE凈化后用高效液相色譜-紫外法進(jìn)行測(cè)定。表2、表3結(jié)果表明，加標(biāo)量在50～250 μg/kg時(shí)9種磺胺類藥物回收率為77.4%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%～11.5%，試驗(yàn)的回收率和穩(wěn)定性均較好。加標(biāo)濃度為10～25 μg/kg時(shí)，回收率有不同程度的下降，為63.1%～81.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.5%～15.2%。痕量分析回收率大于60%、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于30%時(shí)符合藥物殘留分析的國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（單位：%）

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果（單位：%）

3 結(jié)論

本文采用基體固相擴(kuò)散和固相萃取相結(jié)合的技術(shù)對(duì)蜂蜜中磺胺類殘留進(jìn)行了提取和凈化，建立了高效液相色譜-紫外法檢測(cè)蜂蜜中磺胺類藥物殘留量的方法。該方法對(duì)蜂蜜的加標(biāo)回收率為63.1%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%～15.2%，最低檢出限為4～6 μg/kg。因此，該方法具有檢出限低、回收率高、重復(fù)性好、靈敏度高和適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于蜂蜜中磺胺類藥物殘留的分析檢測(cè)。