李瑩瑩，楊春靜，雷敬衛(wèi)，賈豪，張維方，龔海燕，紀(jì)亮

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046； 2.河南省中藥質(zhì)量控制與評價(jià)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床常見的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于中老年人群[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為該病屬“骨痹”范疇，《素問·痹論》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，即風(fēng)寒濕入侵膝關(guān)節(jié)，導(dǎo)致氣血不通，經(jīng)絡(luò)痹阻，久之引發(fā)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬、腫脹積液[3]，臨床治療常以活血化瘀、通絡(luò)止痛為主[4-6]。中藥塌漬療法最早見于《五十二病方》，通過中藥煎湯外敷治療疾病。《黃帝內(nèi)經(jīng)》有云“其有邪者，漬形以為汗”，元代《外科精義》載“溻漬法，瘡瘍在四肢者，溻漬之。疏導(dǎo)腠理，通調(diào)血脈，使無凝滯也”。傳統(tǒng)中藥塌漬方法是用6～8層紗布浸透藥液做為藥墊直接濕敷于患處結(jié)合特定電磁波治療器照射患處的一種外治法[7-8]。中藥外用塌漬液有其獨(dú)特優(yōu)勢，臨床研究表明，采用中藥塌漬液治療老年KOA的總有效率顯著高于對照組[9]；實(shí)驗(yàn)研究表明，活血痛痹湯塌漬液可通過下調(diào)下游基因MMP3、MMP13、BMP2等的表達(dá)治療兔KOA[10]。目前，中藥塌漬液治療KOA已廣泛用于臨床。炎痛止(yantongzhi，YTZ)塌漬液是河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院自擬處方，由紅花、川芎、三七、血竭、透骨草、伸筋草、杜仲、制乳香、制沒藥、蜈蚣、狗脊、地龍、冰片、自然銅14味藥物組成，用于住院期KOA患者的治療。處方采用冷浸法，將上述中藥材混勻，置容器內(nèi)輔以70%乙醇密閉，浸漬15～30 d 濾過，塌漬患處[11]。

中醫(yī)藥現(xiàn)代化趨勢要求確定中醫(yī)藥自我主體的前提下，以科學(xué)技術(shù)為依托，吸收利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)成果，建立嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒▽W(xué)體系，形成科學(xué)模式，從而建立中醫(yī)藥學(xué)自身標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)[12-13]。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)是一種綜合的、可量化的分析評價(jià)方法[14]，化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別并分析量化[15]，兩者相結(jié)合是目前相對完整評價(jià)藥材質(zhì)量整體性的方法，也是現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段同傳統(tǒng)中醫(yī)療法相結(jié)合的有效研究方法。目前，有學(xué)者利用高效液相聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)建立三七藥酒、馮了性風(fēng)濕跌打藥酒的指紋圖譜[16-17]?，F(xiàn)今對于塌漬液成分研究較少，臨床應(yīng)用中對其具體浸漬時(shí)間僅有經(jīng)驗(yàn)值，而不同浸漬時(shí)間下塌漬液內(nèi)在成分是否一致，何為發(fā)揮藥效的主要成分仍不清楚?；诖?，本研究采集YTZ不同浸漬時(shí)間塌漬液的HPLC指紋圖譜，結(jié)合模式識別方法(相似度評價(jià)、灰色關(guān)聯(lián)度分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析)對其進(jìn)行評價(jià)，旨在探討YTZ浸漬過程中的動(dòng)態(tài)信息及不同浸漬時(shí)間的整體化學(xué)組分差異，為研究YTZ塌漬液物質(zhì)基礎(chǔ)及浸漬平衡點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋、FW-100型高速多功能粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；HQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；四號藥典篩(浙江上虞市五四儀器篩具廠)；BSA224S-CW型萬分之一天平、CPA225D型十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.2 材料羥基紅花黃色素A對照品(純度≥98.11%)、川芎嗪對照品(純度≥99.95%)、人參皂苷Rg1對照品(純度≥99.44%)(成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-20080111、MUST-19051403、MUST-19022811)；血竭素高氯酸鹽對照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：Y17M97H56341)；甲醇(色譜純，美國Tedia公司，批號：MS1922-801)。本實(shí)驗(yàn)所用飲片由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 YTZ塌漬液HPLC指紋圖譜

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取適量羥基紅花黃色素A、川芎嗪、人參皂苷Rg1及血竭素高氯酸鹽對照品至5 mL容量瓶中，加入甲醇定容至5 mL，即得混合對照品溶液。

2.1.2 樣品制備根據(jù)處方稱取紅花、川芎、三七、血竭、透骨草、伸筋草、杜仲、制乳香、制沒藥、蜈蚣、狗脊、地龍、木瓜、冰片和自然銅粗粉各三份，分別置于廣口瓶中，編號為1、2、3。加入處方藥材8倍量的70%乙醇，取浸漬1～50天的塌漬液。將三個(gè)瓶子中1～50 d塌漬液樣品編號為1-1、1-2…1-50，2-1、2-2…2-50，3-1、3-2…3-50。

2.1.3 供試品溶液制備取25 mL樣品溶液，并補(bǔ)足廣口瓶內(nèi)減失體積，過濾后精密吸取20 mL續(xù)濾液置65 ℃水浴得恒重浸膏，30%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至 5 mL 容量瓶中，加入30%甲醇定容至5 mL，過 0.45 μm 微孔濾膜即得。

2.1.4 色譜條件Venusil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)；梯度洗脫(0～15 min，5%～10%A；15～20 min，10%～16%A；20～40 min，16%～31.5%A；40～50 min，31.5%～32%A；50～60 min，32%～34%A；60～75 min，34%～37%A；75～90 min，37%～41%A；90～100 min，42%A；100～110 min，42%～44%A；110～120 min，44%～48%A；120～130 min，48%～51%A；130～135 min，51%～52%A；135～145 min，52%～100%A；145～150 min，100%A)；流速 1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長203 nm。

2.1.5 方法學(xué)考察精密度試驗(yàn)：精密量取1-40塌漬液樣品1份，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1.4項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以川芎嗪為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值為0.00%～0.79%，相對峰面積RSD值為0.00%～1.87%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取1-40塌漬液樣品6份，按2.1.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按照2.1.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以川芎嗪為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間RSD值為0.00%～1.31%，相對峰面積RSD為0.00%～2.90%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取1-40塌漬液樣品1份，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h按2.1.4項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，以川芎嗪為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對保留時(shí)間RSD值為0.00%～0.85%，相對峰面積RSD為0.00%～1.93%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.6 YTZ塌漬液指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)取YTZ供試品溶液，按照2.1.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，采集HPLC指紋圖譜。應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜評價(jià)軟件(2004A)對YTZ塌漬液供試品溶液的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，采用中位數(shù)法將3份第 1～50天塌漬液的HPLC指紋圖譜生成HPLC疊加圖譜S1～S50。將S1～S50圖譜導(dǎo)入相似度評價(jià)軟件，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.3，采用中位數(shù)法，經(jīng)全譜峰匹配后生成對照圖譜，對照圖譜相似度結(jié)果為0.428～0.747。該相似度結(jié)果低，可能是由于不同浸漬時(shí)間的YTZ塌漬液差異較大。以相似度結(jié)果為篩選條件，對S1～S50的指紋圖譜進(jìn)行篩選，經(jīng)篩選后S1～S50圖譜分為兩組，S1～S26相似度為0.922～0.991，S27～S50相似度為0.944～0.994。兩組樣品均標(biāo)定11個(gè)共有峰，其中峰1為羥基紅花黃色素A，峰4為川芎嗪，峰10為人參皂苷Rg1，峰11為血竭素高氯酸鹽，且川芎嗪(峰4)的重復(fù)性和分離度都較好。見圖1。

圖1 不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液疊加指紋圖譜及對照圖譜

2.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.2.1 原始數(shù)據(jù)的規(guī)格化處理基于50份HPLC指紋圖譜中的11個(gè)共有峰面積，建立不同時(shí)間YTZ質(zhì)量灰色模式識別數(shù)據(jù)集，由于其量綱不統(tǒng)一，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理，采用均值化處理，使規(guī)格化后的數(shù)據(jù)具有可比性。設(shè)有a個(gè)樣品，每個(gè)樣本有b項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)，組成評價(jià)單元序列{Xtk}(t= 1，2，3…a；k= 1，2，3…b；本實(shí)驗(yàn)中 a=50，b=11)，按公式1對不同時(shí)間YTZ指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理。式中，Ytk為規(guī)格化處理后的數(shù)據(jù)，Xtk為原始數(shù)據(jù)，Xk為a個(gè)樣品第k個(gè)指標(biāo)的均值。

2.2.2 參考序列的選擇采用灰色關(guān)聯(lián)度為綜合評價(jià)指標(biāo)時(shí)需要確定參考序列，即需要選出最優(yōu)參考序列和最差參考序列，最優(yōu)參考序列{YLk} (k= 1，2，3…b)，是a個(gè)樣品中各項(xiàng)對應(yīng)指標(biāo)的最大值，最差參考序列{Ysk} (k= 1，2，3…b)，為a個(gè)樣品中各項(xiàng)對應(yīng)指標(biāo)的最小值。

2.2.3 關(guān)聯(lián)度計(jì)算關(guān)聯(lián)度是指對于兩個(gè)數(shù)據(jù)列間的因素，隨時(shí)間或不同對象而變化的關(guān)聯(lián)性大小的量度。不同數(shù)據(jù)組間相對關(guān)聯(lián)度大、分布范圍密集表明分布質(zhì)量更優(yōu)。

根據(jù)公式依次計(jì)算出不同浸漬時(shí)間樣品的相對關(guān)聯(lián)度，并按照ri大小排序。由灰色關(guān)聯(lián)度分析計(jì)算結(jié)果，根據(jù)50 d樣品的11個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)的分析，浸漬1～26 d及27～50 d的相對關(guān)聯(lián)度范圍分別是0.278 3～0.502 2和0.468 2～0.659 4，表明浸漬27 d后塌漬液的質(zhì)量明顯優(yōu)于浸漬前 26 d 的塌漬液質(zhì)量。見表1。

表1 不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液的相對關(guān)聯(lián)度

2.3 聚類分析以不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液的11個(gè)共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用Ward法，以平方Euclidean距離為分類依據(jù)，當(dāng)平方Euclidean距離為5時(shí)，塌漬液樣品被分為4類，浸漬6～26 d、1～5 d、42～50 d、27～41 d分別聚為一類，表明浸漬時(shí)間對YTZ塌漬液內(nèi)在質(zhì)量存在影響；當(dāng)平方Euclidean距離為14時(shí)，塌漬液樣品被分為3類，1～26 d、42～50 d、27～41 d分別聚為一類，表明浸漬42～50 d，27～41 d塌漬液與浸漬前26 d存在一定差異；當(dāng)平方Euclidean距離為20時(shí)，塌漬液樣品聚為兩大類，1～26 d、27～50 d聚為兩類，表明兩個(gè)樣品組之間存在明顯差異。見圖2。

圖2 YTZ不同浸漬時(shí)間塌漬液聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析以不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液11個(gè)共有峰峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維因子分析，抽樣適合性檢驗(yàn)(kaiser-meyer-olkin，KMO)統(tǒng)計(jì)量為0.805>0.7，巴特利球體(bartlett)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為0.000，表明各因子間關(guān)聯(lián)性好，適合主成分分析。以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)，提取出2個(gè)主成分，二者的方差貢獻(xiàn)率分別為52.394%和17.182%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為69.576%>60%，表明該分析能比較全面地表征其化學(xué)成分特征。根據(jù)方差貢獻(xiàn)率，計(jì)算不同浸漬時(shí)間塌漬液的綜合得分。見表2、表3。

表2 主成分分析方差貢獻(xiàn)率

表3 不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液的綜合得分

2.5 正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)以不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液11個(gè)共有峰峰面積為變量，運(yùn)用SIMCA-P 14.1軟件，采用有監(jiān)督模式的OPLS-DA對樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同浸漬時(shí)間樣品可明顯區(qū)分開，與聚類分析和主成分分析結(jié)果基本一致，表明不同浸漬時(shí)間樣品內(nèi)部化學(xué)特征信息存在明顯差異。對變量重要性投影值(variable importance in the project，VIP)參數(shù)進(jìn)行分析，篩選出對樣品分類貢獻(xiàn)較大的成分。VIP<1時(shí)，表明該變量對模型貢獻(xiàn)度較低；VIP>1表示該變量對整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平，其中VIP>1的峰為峰1(羥基紅花黃色素A)、峰11(血竭素高氯酸鹽)、峰4(川芎嗪)、峰10(人參皂苷Rg1)，提示這4種成分在區(qū)分不同浸漬時(shí)間的YTZ塌漬液中起到重要作用，是產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志性成分。見圖3、圖4。

圖3 OPLS-DA散點(diǎn)得分圖

圖4 VIP得分圖

3 討論

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇作為復(fù)溶溶劑，不同流動(dòng)相(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水)，不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，不同波長(203 nm、210 nm、230 nm、280 nm、310 nm)，不同體積流速(0.8 mL·min-1、1 mL·min-1)，不同進(jìn)樣量(10 μL、20 μL) 條件下檢測時(shí)，以甲醇-水為流動(dòng)相，在柱溫25 ℃、波長203 nm、流速1 mL·min-1、進(jìn)樣量20 μL條件下檢測出現(xiàn)的色譜峰分離度好，基線平穩(wěn)，響應(yīng)值較好。

中藥塌漬液質(zhì)量與其內(nèi)在化學(xué)成分種類及含量相關(guān)。本研究所建立的HPLC指紋圖譜可反映其中多數(shù)具有紫外吸收的化學(xué)成分信息，對不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液指紋圖譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，浸漬1～26 d，27～50 d YTZ指紋圖譜相似度均大于0.9，表明浸漬1～26 d時(shí)塌漬液成分差異不大，且浸漬 27～50 d YTZ塌漬液成分差異不大，而浸漬1～50 d的YTZ塌漬液的相似度在0.428～0.747間，表明 1～50 d YTZ塌漬液成分差異較大。以11個(gè)共有峰的峰面積為指標(biāo)，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析、主成分分析發(fā)現(xiàn)浸漬27～50 d的塌漬液質(zhì)量優(yōu)于1～26 d的塌漬液質(zhì)量。聚類分析中1～26 d與27～50 d的YTZ塌漬液可明顯聚為兩大類。利用有監(jiān)督下的 OPLS-DA分析篩選出區(qū)分不同浸漬時(shí)間YTZ塌漬液的主要標(biāo)志性成分分別為羥基紅花黃色素A、血竭素高氯酸鹽、川芎嗪、人參皂苷Rg1。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)歸屬于紅花，是紅花活血化瘀的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報(bào)道HSYA可通過促進(jìn)核仁素表達(dá)，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)水平，進(jìn)而促進(jìn)血管新生[18-19]；血竭素高氯酸鹽歸屬于血竭，有活血、止血、鎮(zhèn)痛抗炎的作用[20]；川芎嗪歸屬于川芎，是川芎的特征性生物堿[21]，可上調(diào) 5-羥色胺受體達(dá)到鎮(zhèn)痛作用，還可抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導(dǎo)的凝血作用，可能是川芎活血行氣及鎮(zhèn)痛的基礎(chǔ)物質(zhì)[22-23]；人參皂苷Rg1歸屬于三七，是三七活血止血雙向作用的代表成分[24]，可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板黏附和聚集[25]。本研究的指紋圖譜中所指認(rèn)的四種成分可分別代表YTZ處方中紅花、血竭、川芎、三七的主要藥效成分，并在文獻(xiàn)中已證實(shí)其有活血化瘀、鎮(zhèn)痛消炎之效，結(jié)合模式識別分析可嘗試將這4種成分作為評價(jià)YTZ塌漬液質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

中藥塌漬又稱為中藥蒸煮療法、藥透療法等，是中醫(yī)外治法中的一種，塌漬液濕敷達(dá)到消炎、鎮(zhèn)痛、止癢和抑制滲出等作用。塌漬液臨床療效確切，而在推廣使用過程中卻缺乏標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，如浸漬時(shí)間不定、物質(zhì)基礎(chǔ)不明確等問題。本研究初步建立了YTZ塌漬液不同浸漬時(shí)間的HPLC指紋圖譜，可將其用于塌漬液浸漬過程的質(zhì)量分析，而在研究過程中確定的4種差異性成分在YTZ塌漬液中如何發(fā)揮其活血化瘀、鎮(zhèn)痛消炎的藥效作用，有待進(jìn)一步研究。