李俊，陳偉，楊明武，何珺

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025;2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025)

銀杏葉為銀杏科植物銀杏(Ginkgobilobea.L.)的干燥葉,味微苦,性平,具有益心、活血止痛等功效[1-4]。銀杏葉中的活性成分有黃酮、萜內(nèi)酯和有機(jī)酸等[5]，其中奎寧酸和莽草酸含量高達(dá)3%～5%。奎寧酸具有抗氧化性[6]，莽草酸具有抗菌、抗炎等藥理活性[7]。

莽草酸、奎寧酸為合成達(dá)菲原料[6，8]。目前市場上莽草酸主要來源于八角，但近年來八角價格不斷攀升，導(dǎo)致工業(yè)成本提高，市場急需尋求低價原料代替[9-11]。在銀杏葉中黃酮及內(nèi)酯提取工藝基礎(chǔ)上[7]，對莽草酸和奎寧酸進(jìn)行綜合提取工藝研究，充分利用銀杏葉資源。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

奎寧酸對照品(批號20112423，上海同田生物技術(shù)股份有限公司，含量>98%)；莽草酸對照品(批號20111203，上海同田生物技術(shù)股份有限公司，含量>98%)；磷酸、無水乙醇均為分析純；娃哈哈純凈水；甲醇，色譜純；蒸餾水,自制;銀杏葉，4月采自貴州省遵義市湄潭縣3年樹齡的銀杏，60 ℃真空干燥24 h。

Agilent Technologies 1260 InfinityHPLC-示差檢測器;BT25S電子分析天平；HH.W21-600C型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 提取實(shí)驗(yàn)

按料液比1∶10 g/mL;加入體積分?jǐn)?shù)85%的乙醇，在70 ℃提取2 h。

1.3 奎寧酸和莽草酸含量測定

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱(250×4.6 mm,5 μm)；流動相為甲醇：0.4%磷酸水(1∶99，v/v)；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 溶液制備 分別取奎寧酸、莽草酸對照品適量，精密稱定，加水制得對照品溶液。精密稱定銀杏葉1.00 g，按照相應(yīng)條件提取，精密移取銀杏葉提取液1 mL，以水定容至10 mL，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，注入進(jìn)樣瓶，即得供試品溶液。按擬定色譜條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance

圖2 供試品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the test product

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取 0,2.4,4,6,8,10 mL的0.25 mg/mL奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL試管中，加水稀釋至刻度線，混勻，制成系列奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；精密量取0,1.6,3.2,3.5,4.8 mL的0.15 mg/mL莽草酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL試管中，加水稀釋至刻度線，混勻，制成系列莽草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照擬定方法條件進(jìn)行含量測定。以奎寧酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=115 477X+136.4，r=0.99，表明在0～ 0.25 mg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與奎寧酸濃度有良好的線性關(guān)系。以莽草酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=132 125X+190.39，r=0.99，表明在0～0.30 mg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與莽草酸濃度有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溫度

料液比1∶10 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，提取時間2 h，考察提取溫度對提取效果的影響,結(jié)果見表1。

表1 提取溫度對奎寧酸和莽草酸提取影響(n=3)Table 1 The effect of extraction temperatures on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表1可知，隨著溫度升高，銀杏葉中奎寧酸和莽草酸提取率越高，70,90 ℃時，奎寧酸和莽草酸提取含量最高，達(dá)3.8%左右，變化不大。因此，優(yōu)先提取溫度為70 ℃。

2.2 提取醇濃度

料液比1∶10 g/mL，提取溫度70 ℃，提取時間2 h，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響,結(jié)果見表2。

表2 乙醇濃度對奎寧酸和莽草酸提取影響(n=3)Table 2 The effect of ethanol concentrations on the extraction of quinic acid and shikimic acid (n=3)

由表2可知，乙醇濃度越高，奎寧酸提取率越低，而莽草酸整體提取率變化不大。乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%時，奎寧酸含量達(dá)4.5%，莽草酸含量達(dá)3.9%，綜合提取率最高。但是，先前對銀杏葉中黃酮、內(nèi)酯、莽草酸綜合提取研究表明，采用乙醇濃度為70%最好，而70%乙醇提取奎寧酸提取效果為30%提取時的84.3%。因此，考慮銀杏葉中黃酮、內(nèi)酯、莽草酸三個組分提取效率，確定提取溶劑為70%乙醇。

2.3 提取時間及次數(shù)的考察

料液比為1∶10 g/mL，提取溫度為70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，每次提取1 h，每次提取后進(jìn)行抽濾，濾渣進(jìn)行下一次提取。提取次數(shù)對提取效果的影響見表3。

表3 提取次數(shù)對提取效果的影響(n=3)Table 3 The influence of the number of extractions on the extraction effect(n=3)

由表3可知，第1次提取時，莽草酸提取率達(dá)70.35%，奎寧酸提取率達(dá)60.15%；第2次提取時，莽草酸總的提取率達(dá)20.55%，奎寧酸總的提取率達(dá)25.78%；第2次提取時，奎寧酸總的提取率為9.97%，莽草酸總的提取率為6.88%；第4次提取時，奎寧酸和莽草酸的提取率低至3.33%和2.33%。因此，綜合生產(chǎn)成本考慮，確定提取2次，第1次提取2 h，2次提取1 h，總的提取時間為3 h，奎寧酸總的提取率為96.67%，莽草酸總的提取率為97.77%。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表4，結(jié)果見表5，方差分析見表6、表7。

表4 因素水平表(n=3)Table 4 Factor and level table (n=3)

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=2)Table 5 Orthogonal experimental results (n=2)

表6 奎寧酸提取方差分析Table 6 Results of analysis of variance of quinic acid

表7 莽草酸提取方差分析Table 7 Analysis of variance results of shikimic acid

由表5可知，莽草酸含量變化不大，而奎寧酸含量波動較大。所以，將奎寧酸作為正交提取含量考察主要指標(biāo)，因素的影響強(qiáng)度依次為B>D>C>A,A1B1C3D3為最優(yōu)方案,即料液比1∶8 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為70 ℃，提取時間3 h。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

平行取4組1.0 g銀杏葉，精密稱定，加8 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，70 ℃條件下，提取2次，即第1次為2 h，第2次為1 h,提取時間3 h。對提取液進(jìn)行含量測定，綜合評分=奎寧酸含量評分+莽草酸含量評分;奎寧酸含量評分=(奎寧酸提取量/奎寧酸最大提取量)×100×0.5;莽草酸含量評分= (莽草酸提取量/莽草酸最大提取量)×100×0.5。結(jié)果見表8。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 8 Verification experiment

由表8可知，正交實(shí)驗(yàn)所得最佳參數(shù)在對銀杏葉中奎寧酸和莽草酸進(jìn)行綜合提取時，能夠得到穩(wěn)定高效的提取量，奎寧酸的含量達(dá)5.29%，莽草酸含量達(dá)4.90%，綜合評分達(dá)98.51。表明該工藝參數(shù)穩(wěn)定可行，可用于銀杏葉中奎寧酸和莽草酸的綜合提取。

3 結(jié)論

對銀杏葉中奎寧酸和莽草酸進(jìn)行綜合提取時，最優(yōu)條件為：料液比1∶8 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取溫度為70 ℃，提取時間為3 h。在第1次提取時間達(dá)到2 h以后，為避免提取溶液達(dá)到飽和狀態(tài)，采用新的溶劑進(jìn)行第2次提取，從而達(dá)到提高提取率的目的?？鼘幩岷?.29%,莽草酸含量4.90%。