馮月超, 王建鳳, 侯 帆, 丁 奇, 楚弘宇, 劉 艷

(北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測試研究所(北京市理化分析測試中心), 北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心, 北京 100089)

食源性興奮劑是指來源于食品的興奮劑,包括一般性食品及保健食品從生產(chǎn)到加工過程中天然存在或故意添加而殘留的興奮劑成分[1]。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)發(fā)布的《2021年禁用清單》[2]中明確規(guī)定β2-激動劑、蛋白同化制劑、糖皮質(zhì)激素、利尿劑等興奮劑為運(yùn)動員禁、限用物質(zhì)。由于食物種類非常多,而且從農(nóng)田到餐桌供應(yīng)鏈條長,食源性興奮劑的防范難度較大,運(yùn)動員因食物導(dǎo)致的興奮劑陽性案例在體育賽事中屢見不鮮[3,4]。此外,一些合成類孕激素已經(jīng)被我國明令禁止,如《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號)》(2019年12月)中規(guī)定食用動物中禁止使用醋酸美侖孕酮等激素。為了保障大型體育賽事的成功舉辦,防止違禁物質(zhì)污染食物,評估食品中食源性興奮劑等激素的風(fēng)險(xiǎn),建立高通量、快速、準(zhǔn)確的食源性興奮劑等激素的檢測方法非常必要。

食源性興奮劑等激素物質(zhì)的檢測方法主要有色譜-質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法、生物芯片等技術(shù)[5,6],色譜-質(zhì)譜法因準(zhǔn)確度高、靈敏度高、檢測通量高等優(yōu)勢是食源性興奮劑等激素的主要檢測手段,但依然面臨較大挑戰(zhàn),主要有以下2點(diǎn):(1)同類物質(zhì)極性差異太大,采用同一種檢測方法難以獲得較好的回收率,比如苯丙酸諾龍的極性較弱,導(dǎo)致樣品處理中因?yàn)槊撝^程而有較大損失[7,8];(2)對食源性興奮劑檢出限的要求高,通常為痕量甚至是超痕量,且食品基質(zhì)復(fù)雜,基質(zhì)效應(yīng)顯著[9],樣品前處理步驟繁瑣。目前傳統(tǒng)的固相萃取[10-12]和溶劑萃取[13]等前處理過程復(fù)雜,檢測周期較長,近年發(fā)展的濾過型凈化柱法則存在成本高的問題[14,15]。QuEChERS方法已應(yīng)用在食源性興奮劑和孕激素的檢測中[16],但多數(shù)研究僅針對單一種類的物質(zhì)[17-23],研究肉中興奮劑高通量多殘留檢測方法的較少[24-28]。本研究以運(yùn)動員禁、限用興奮劑和孕激素為研究對象,采用QuEChERS前處理方法,建立了一種同時(shí)測定畜禽肉中44種食源性興奮劑和6種孕激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測方法,該方法通用性較強(qiáng),實(shí)現(xiàn)了高通量高效率,可為國內(nèi)外體育賽事中肉類興奮劑檢測提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料和試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ-S串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,美國WATERS;高速冷凍離心機(jī):GR 22 GIII,日本HITACHI;氮吹儀:N-EVAPTM112,配備OA-SYSTM水浴加熱裝置,美國Organomation;多管渦旋混勻儀:MS 200,杭州瑞誠儀器有限公司;渦旋混合器:Vortex-genie 2,美國Scientific Industries;數(shù)控超聲波清洗器:KQ-500 DE,昆山市超聲儀器有限公司。

甲醇、乙腈(色譜純)均購于美國Fisher Scientific有限公司;無水硫酸鎂、氯化鈉、中性氧化鋁(100～200目)購自國藥集團(tuán)試劑公司;N-丙基乙二胺鍵合固相吸附材料(PSA, 40～60 μm)、十八烷基鍵合硅膠吸附材料(C18, 40～60 μm)、氨基吸附劑(NH2, 40～60 μm)均購于博納艾杰爾有限公司;實(shí)驗(yàn)室用水由Milli-Q超純水凈化處理系統(tǒng)制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

50種被測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度大于95%)和11種內(nèi)標(biāo)(100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液)購于美國Sigma-Aldrich、德國Dr. Ehrenstorfer等公司。被測物按照物質(zhì)的分類用甲醇配制成1～10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,內(nèi)標(biāo)用甲醇配制成質(zhì)量濃度均為100 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)中間液。置于-20 ℃冷凍保存。

1.3 樣品處理

1.3.1提取

準(zhǔn)確稱取粉碎均質(zhì)后的肉樣品5.0 g于50 mL螺蓋離心管中,加入40 μL混合內(nèi)標(biāo)中間液,再加入5 mL超純水,渦旋10 s后,準(zhǔn)確加入20 mL含0.5%乙酸的乙腈溶液,振蕩提取15 min,加入1.0 g氯化鈉和4.0 g無水硫酸鎂,快速混勻,繼續(xù)振蕩10 min, 8 000 r/min離心5 min。

1.3.2凈化

移取上清液10 mL于另一事先裝入凈化劑(PSA 165 mg+C18165 mg+中性氧化鋁165 mg+無水硫酸鎂900 mg)的螺蓋離心管中,振蕩混勻10 min, 8 000 r/min離心5 min。準(zhǔn)確移取上清液5 mL,置于氮吹儀上45 ℃氮?dú)獯蹈?加入1.0 mL甲醇/水(含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨)(1/9, v/v),渦旋復(fù)溶,過0.22 μm微孔濾膜后,UPLC-MS/MS待測。

1.3.3基質(zhì)空白提取液的制備

取不含被測物的雞肉樣品,不加內(nèi)標(biāo)物,按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)的操作處理,得到基質(zhì)空白提取液,用于配制系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1液相色譜

色譜柱:Waters Acquity BEH C18反相液相色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。流動相:A為甲醇,B為含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨的水溶液,流速為0.3 mL/min,梯度洗脫程序:0～0.5 min, 5%A; 0.5～1.0 min, 5%A～10%A; 1.0～6.0 min, 10%A～70%A; 6.0～8.0 min, 70%A～80%A; 8.0～9.0 min, 80%A～100%A; 9.0～10.0 min, 100%A; 10.1～12.0 min, 5%A。

1.4.2質(zhì)譜

電噴霧正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,毛細(xì)管電壓:0.5 kV;錐孔電壓:30 V;脫溶劑氣流速:650 L/h;脫溶劑氣溫度:450 ℃;錐孔氣流速:150 L/h。其他質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件選擇

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將100 μg/L單一標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源,進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描,在最佳碰撞電壓下確認(rèn)目標(biāo)化合物的母離子m/z值,然后進(jìn)行二級質(zhì)譜優(yōu)化,通過優(yōu)化碰撞能量,對碎片離子進(jìn)行全掃描,選取響應(yīng)最強(qiáng)與次強(qiáng)的碎片離子作為定量和定性離子,經(jīng)優(yōu)化后得到的質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

表 1 50種目標(biāo)分析物及11種內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間及主要質(zhì)譜參數(shù)

表 1 (續(xù))

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有被測物均在ESI+下具有較強(qiáng)的信號值,大部分被測物可獲得較高豐度的[M+H]+峰。螺內(nèi)酯的相對分子質(zhì)量為416.58,但在ESI+或ESI-模式下都找不到其母離子信息,在m/z341.5處出現(xiàn)了脫去乙?；鶐€基的[M-C2H3OS]+峰,該峰信號穩(wěn)定,可作為螺內(nèi)酯的一級質(zhì)譜信號,其二級特征離子信號重現(xiàn)性好,可滿足監(jiān)測要求。

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

先后采用乙腈、甲醇、水、0.1%甲酸水溶液、含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨的水作為流動相,觀察標(biāo)準(zhǔn)溶液各個(gè)色譜峰的峰形、分離度等。結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲酸的加入能夠明顯提高被測物的離子化效率,提高分離度,再加入乙酸銨能夠使大部分被測物的峰信號明顯增強(qiáng)。用乙腈時(shí)較早出峰的β2-激動劑類在濃度高時(shí)峰有分叉現(xiàn)象,甲醇-水(含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨)為流動相時(shí)所有物質(zhì)的峰形較好。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5 cm長的色譜柱無法將同分異構(gòu)體美睪酮和美雄諾龍的色譜峰分離,最終選擇10 cm長的色譜柱。在本實(shí)驗(yàn)條件下,被測物中兩對具有相同母離子和子離子的同分異構(gòu)體(美睪酮和美雄諾龍)和同系物(螺內(nèi)酯和坎利酮)的色譜峰均能夠較好的分離,見圖1。

圖 1 同分異構(gòu)體(美睪酮和美雄諾龍)和同系物(螺內(nèi)酯和坎利酮)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of pairs of isomers (mesterolone and mestanolone) and homologs (spironolactone and canrenone)

50種目標(biāo)化合物及11種內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖見附圖(詳見https://www.chrom-China.com)。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的選擇

考察了乙腈中分別加入0、5%、10%、20%、50%的甲醇(均含有0.5%乙酸)6種提取劑的提取效果。隨著甲醇在乙腈體系中的比例增大,其蛋白沉淀效果越來越差,在樣品前處理-氮吹濃縮過程中可以看到有明顯的白色脂類析出,復(fù)溶后過濾膜壓力大,且溶液混濁,最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2提取溶劑酸度的考察

基于絕大多數(shù)目標(biāo)物均帶有酸性基團(tuán),采用酸溶液提取更有利于化合物的溶出,分別考察了乙腈中含0.1%、0.5%、1%、2%乙酸的提取效果,結(jié)果見圖2,β2-激動劑、β-阻斷劑類、蛋白同化激素在酸度超過0.5%時(shí),有基質(zhì)干擾,回收率有降低的趨勢;糖皮質(zhì)激素、孕酮和利尿劑對提取液中乙酸的比例不敏感。當(dāng)采用含0.5%乙酸的乙腈溶液作為取溶劑時(shí),所有被測物的回收率均大于50%,確定為最優(yōu)提取劑。

圖 2 采用含不同量乙酸的乙腈做提取液時(shí)回收率大于50%的化合物個(gè)數(shù)占該類化合物總個(gè)數(shù)的百分比(基質(zhì)為雞肉) Fig. 2 Percentages of compounds with recoveries greater than 50%, using an extraction solution of acetonitrile containing different proportions of acetic acid in the chicken matrix

2.2.3樣品凈化劑的選擇

對QuEChERS方法中常用的4種吸附劑(PSA、C18、NH2、中性氧化鋁)單獨(dú)及組合使用的凈化效果和吸附作用進(jìn)行了考察。

單獨(dú)采用NH2吸附劑時(shí),大約有45%的化合物回收率比使用其他3種凈化劑時(shí)低,且基線噪聲較大,干擾峰多,表明NH2對被測物有吸附作用,凈化效果不理想;PSA、C18和中性氧化鋁對目標(biāo)化合物的吸附相對較小,提取回收良好,且無明顯雜質(zhì)峰干擾。

進(jìn)一步采用以下4種組合方案:① PSA 250 mg+C18250 mg; ② PSA 250 mg+中性氧化鋁250 mg; ③ C18250 mg+中性氧化鋁250 mg; ④ PSA 165 mg+C18165 mg+中性氧化鋁165 mg,考察雞肉基質(zhì)中的加標(biāo)回收率,見圖3。結(jié)果表明,采用凈化劑組合①時(shí)β-興奮劑類回收率最高,但蛋白同化激素、糖皮質(zhì)激素和孕激素的回收率低;采用組合②或③時(shí),蛋白同化激素和糖皮質(zhì)激素回收率較高,但對β-興奮劑類和孕激素回收率不理想;組合④ PSA+C18+Al2O33種復(fù)配時(shí),糖皮質(zhì)激素的回收率較高,且被測物回收率低于20%的最少。

圖 3 采用不同凈化劑時(shí)雞肉基質(zhì)中不同回收率范圍的目標(biāo)物個(gè)數(shù)占總被測物個(gè)數(shù)的比例Fig. 3 Percentages of target compounds in total analytes within different ranges of recoveries using different purifying agents in the chicken matrix ① PSA 250 mg+C18 250 mg; ② PSA 250 mg+neutral alumina 250 mg; ③ C18 250 mg+neutral alumina 250 mg; ④ PSA 165 mg+C18 165 mg+neutral alumina 165 mg.

綜合以上多重因素,本試驗(yàn)最終采用組合④作為最終凈化劑。其中PSA可以去除肉中的脂肪酸類和糖類干擾,C18則對脂肪和非極性化合物的吸附效果比較明顯,中性氧化鋁容易吸附雜環(huán)類、芳香烴和有機(jī)胺等富電化合物,3種聯(lián)合使用達(dá)到凈化的目的,最終上機(jī)溶液為澄清透明溶液。

2.2.4復(fù)溶溶劑的選擇

根據(jù)流動相和各目標(biāo)化合物的溶解性能,考察了3種復(fù)溶溶劑:①乙腈/水(含0.1%甲酸)(1/9, v/v); ②甲醇/水(含0.1%甲酸)(1/9, v/v); ③甲醇/水(含0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨)(1/9, v/v)。通過比較發(fā)現(xiàn),當(dāng)采用溶劑①稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品時(shí),會出現(xiàn)明顯峰分叉現(xiàn)象,而采用②時(shí)則峰形很好,由于使用的流動相中有0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸銨水溶液,又考察了溶劑③,結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶劑②和③沒有明顯差別,最終采用溶劑③作為復(fù)溶溶劑。

2.2.5對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的選擇

對內(nèi)標(biāo)化合物與被測物的匹配進(jìn)行了選擇,以被測物和內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)類似、色譜峰保留時(shí)間相近、回收率接近為原則,選擇最為合適的內(nèi)標(biāo)物。最終確定11種內(nèi)標(biāo)物對應(yīng)50種被測物,具體見表2。

2.2.6基質(zhì)效應(yīng)的考察

為了評價(jià)基質(zhì)效應(yīng),本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值(signal suppression/enhancement, SSE)考察了目標(biāo)物在基質(zhì)中的信號增強(qiáng)或抑制的程度。SSE值在80%～120%之間表明基質(zhì)效應(yīng)影響不大,當(dāng)其高于120%時(shí)顯示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),當(dāng)其低于80%時(shí)顯示基質(zhì)抑制效應(yīng)。本試驗(yàn)以雞肉為基質(zhì)考察了其SSE值,見表2。有2種化合物有基質(zhì)抑制效應(yīng),有12種化合物有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),其余36種化合物無顯著影響。為了消除基質(zhì)的影響,采用基質(zhì)空白提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 方法的線性關(guān)系與靈敏度

采用基質(zhì)空白提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,以被測化合物定量離子對的峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子對峰面積比為縱坐標(biāo)(y),以被測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,考察被測物的線性關(guān)系,結(jié)果見表2,β2-激動劑類(No. 1～19)和β-阻斷劑類(No. 20～22)的線性范圍是0.1～20 μg/L,蛋白同化激素類(No. 23～33)、孕激素類(No. 34～39)、利尿劑類(No. 40～42)的線性范圍是0.2～50 μg/L,糖皮質(zhì)激素類(No. 43～50)的線性范圍0.5～200 μg/L。所有目標(biāo)分析物在其線性范圍內(nèi)線性擬合良好,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均超過0.99。

表 2 50種被測物對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)化合物、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及基質(zhì)效應(yīng)(SSE)

由于定性離子對比定量離子對的信號弱,為了確保能夠準(zhǔn)確定性,本試驗(yàn)以定性離子對的3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的濃度作為檢出限,S/N=10對應(yīng)的濃度作為定量限,見表2。本方法的檢出限范圍為0.03～0.12 μg/kg,定量限范圍為0.1～0.4 μg/kg。莊玥等[25]建立的方法與本研究所建方法和被測物類似,是將待測樣品先經(jīng)乙酸乙酯提取,再經(jīng)氮?dú)獯蹈梢译娑ㄈ?QuEChERS(45 mg PSA+25 mg C18+50 mg無水硫酸鎂)凈化后以HPLC-MS/MS檢測,該方法定量限為0.1～1 μg/kg。國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 21981-2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》的定量限為0.4～2.0 μg/kg。與上述兩種方法相比本方法的定量限更低。

2.4 方法準(zhǔn)確度和精確度

分別考察了雞肉、豬肉、羊肉、牛肉基質(zhì)中目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率和精密度(RSD),并同時(shí)測定相應(yīng)的基質(zhì)空白樣品。結(jié)果見表3～6,雞肉的加標(biāo)回收率范圍50.3%～114.7%,精密度范圍0.42%～15.1%;豬肉的加標(biāo)回收率范圍50.3%～116.3%,精密度范圍0.58%～13.1%;羊肉的加標(biāo)回收率范圍52.0%～119.9%,精密度范圍0.50%～15.0%;牛肉的加標(biāo)回收率范圍50.4%～117.7%,精密度范圍0.76%～13.2%。盡管內(nèi)標(biāo)在整個(gè)試驗(yàn)過程中對目標(biāo)分析物的定量都起著糾偏和校正的作用,但是仍有3種化合物司坦唑醇、美睪酮、美雄諾龍的回收率較低(50%～60%),其他化合物的回收率良好(>60%)。

表 3 雞肉中目標(biāo)物的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

表 4 豬肉中目標(biāo)物的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

表 5 羊肉中目標(biāo)物的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

表 6 牛肉中目標(biāo)物的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

結(jié)果還發(fā)現(xiàn),畜禽肉中常含有一些內(nèi)源性激素,例如本實(shí)驗(yàn)所采用的4種基質(zhì),除雞肉外,其他3種基質(zhì)中均檢出了激素:氫化可的松(豬肉、羊肉、牛肉)、可的松(豬肉、羊肉)、睪酮(羊肉)、孕酮(牛肉),因此推薦用雞肉做基質(zhì)空白配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5 方法比對及樣品的測定

2.5.1方法比對

同時(shí)采用本方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 21981-2008測定了9個(gè)市售肉類樣品。驗(yàn)證的被測物(兩個(gè)方法重合的被測物)有21個(gè):群勃龍、勃地酮、諾龍、雄烯二酮、美雄酮、睪酮、脫氫表雄酮(普拉雄酮)、甲睪酮、康力龍、美睪酮、美雄諾龍、17-α-羥孕酮、醋酸氯地孕酮、孕酮、醋酸甲羥孕酮、波尼松、可的松、氫化可的松、波尼松龍、地塞米松、倍氯米松。測定結(jié)果見表7,除氫化可的松、可的松、雄烯二酮外其他物質(zhì)均未檢出。

為了分析比對自建方法和國標(biāo)方法的一致性,針對氫化可的松和可的松的12組檢測數(shù)據(jù)(見表7),采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算本方法所得結(jié)果與國標(biāo)方法所得結(jié)果的差值,選擇α=5%顯著性水平作為判斷標(biāo)準(zhǔn),當(dāng)n=6時(shí),查t分布雙側(cè)臨界值表t(0.05,n-1)=2.571,經(jīng)計(jì)算得到t氫化可的松=1.62,t可的松=0.33,均小于2.571,說明兩組結(jié)果數(shù)據(jù)沒有顯著差異,兩種方法具有良好的一致性。國標(biāo)方法是首先酶解肉樣品,酶解液用石墨化炭黑柱和氨基柱凈化后測定。本方法的定量限低于或等于國標(biāo)方法的定量限,且國標(biāo)方法過程繁瑣,消耗試劑耗材多,方法測定時(shí)間長,因此本方法優(yōu)于國標(biāo)方法。

表 7 肉類樣品采用兩種方法檢測的結(jié)果(n=2)

2.5.2樣品測定

采用本方法測定了12個(gè)牛肉樣品中的50種化合物,這些牛肉均采自某養(yǎng)殖場,飼料中不含人為添加興奮劑和孕激素。結(jié)果見表8,共檢出了4種化合物。氫化可的松的檢出率最高,含量最高;可的松次之,雄烯二酮和睪酮含量最低。本次檢出的氫化可的松和可的松結(jié)果與莊玥等[25]、楊奕等[29]的測定結(jié)果基本一致,GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定可的松和氫化可的松屬于允許用于食品動物,但不需要制定殘留限量的獸藥。

表 8 12個(gè)牛肉樣品的測定結(jié)果(n=2)

3 結(jié)論

本研究建立了畜禽肉品中50種激素類藥物殘留檢測方法,該方法采用QuEChERS樣品前處理技術(shù),結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法,回收率和精密度穩(wěn)定,具有高通量、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn),能夠滿足檢測需求。該方法可以快速準(zhǔn)確地篩查畜禽肉中的44種食源性興奮劑和6種孕激素藥物殘留,可用于風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警、日常監(jiān)測及應(yīng)急檢測,確保運(yùn)動員食品食源性興奮劑含量在安全范圍內(nèi),該方法的建立可以為重大賽事活動中畜禽肉類食品安全提供有力的技術(shù)支撐。