劉思思，陳長二，陳仕保，傅新龍，李金玲，應光國

廣東省化學品污染與環(huán)境安全重點實驗室/環(huán)境理論化學教育部重點實驗室，華南師范大學環(huán)境研究院/環(huán)境學院，廣東 廣州 511436

苯甲地那銨又名苦精，是一種目前世界上已知的最苦的人工合成化學品。由于其強烈的苦味和較弱的毒性，苯甲地那銨被廣泛添加到家庭日用品、工業(yè)乙醇、防凍劑和動物驅(qū)散劑中[1-3]。苯甲地那銨在環(huán)境中既不會發(fā)生水解，也很難生物降解[4-6]，非常穩(wěn)定。此外，苯甲地那銨對哺乳動物和鳥類具有中等急性毒性(經(jīng)口半致死劑量為196～841 mg/kg)，對魚類的急性毒性較弱(96 h半致死濃度大于1 000 mg/L)[7-8]。因此，苯甲地那銨被認定為一種潛在的PMT (環(huán)境持久性、高遷移性和毒性) 類物質(zhì)[9]。雖然苯甲地那銨用途廣泛且具有環(huán)境持久性，但其直到2017年才在德國污水處理廠中被首次檢出，檢出頻率高達100%，最高質(zhì)量濃度為341 ng/L[10-11]。目前，這種新興環(huán)境微污染物在全球水環(huán)境中的殘留水平和分布特征仍不清楚。

建立可靠的痕量苯甲地那銨檢測方法對監(jiān)測其環(huán)境水平和了解其環(huán)境遷移行為具有重要意義。目前，苯甲地那銨的主要檢測方法有高效液相色譜法[12]、紫外可見分光光度法[13]、毛細管電泳法[14]、液相色譜-大氣壓化學電離質(zhì)譜法[15]等。但這些檢測方法主要適用于各種產(chǎn)品中高濃度的苯甲地那銨檢測(μg/L ～ mg/L)，并不適用于環(huán)境水體中痕量苯甲地那銨的檢測( ng/L)。本文通過優(yōu)化關鍵前處理參數(shù)，建立了水中痕量苯甲地那銨的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，系統(tǒng)考察了該方法的準確度、精密度、基質(zhì)效應、檢出限以及線性范圍，為監(jiān)測環(huán)境水體中苯甲地那銨提供了有力的技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

苯甲地那銨(純度 > 98%，DB)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，苯甲地那銨-D5(芐基-2,3,4,5,6氘取代，純度 > 98%)購自上海甄準生物科技有限公司。甲醇(色譜純)購自德國Merk公司；甲酸(色譜純)和氨水(氨體積分數(shù) ≥ 25%，色譜純)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。Oasis HLB固相萃取小柱(200 mg，3 mL)購自美國Waters公司，混合型陽離子交換(MCX)小柱(200 mg，3 mL)和弱陽離子交換(WCX)小柱(200 mg，3 mL)均購于上海安譜實驗科技有限公司，純水和超純水由法國Elga水純化系統(tǒng)(威立雅)提供。

固相萃取真空裝置(16位，上海安譜公司)；氮吹濃縮裝置(MTN-2800D，天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC Acquity?-Xevo TQS，美國Waters公司)。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液的配制：準確稱取標準品0.001 0 g，用甲醇溶解并定容到10 mL的棕色容量瓶中，配制成100 mg/L的標準儲備溶液，在-18 ℃下避光保存(6個月內(nèi)使用)。

標準工作溶液的配制：取上述標準儲備液適量，用甲醇定容至10 mL，配制成已知濃度的中間標準工作溶液。用0.1% (體積分數(shù))甲酸水溶液(初始流動相)稀釋成系列濃度的標準工作液，密封于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

200 mL水樣過0.7 μm 孔徑玻璃纖維(GF/F)濾膜去除懸浮顆粒物后，以1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8以上。采用WCX固相萃取小柱(200 mg，3 mL)來富集水樣。上樣前，SPE小柱先分別以3 mL甲醇和3 mL純水進行活化和平衡。上樣流速控制在2 ～ 3 mL/min。采用3 mL 體積分數(shù)為5%的氨水水溶液進行淋洗，然后抽干30 min。最后，以5 mL 2%(體積分數(shù)，下同)甲酸-甲醇洗脫SPE小柱上的目標物，收集于氮吹管中。目標物在50 ℃下氮吹至近干，以1 mL初始流動相重溶待測。

1.4 儀器分析

色譜柱為ACUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；0.1% (體積分數(shù))甲酸水溶液為流動相A，甲醇為流動相B；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programme

質(zhì)譜條件：離子源采用電噴霧離子源(ESI+)；分析物在正離子掃描下以多反應監(jiān)測模式(MRM)分析(圖1)；優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表2。其他優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)：毛細管電壓為3.0 kV；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣溫度為300 ℃；脫溶劑氣流量為800 L/h；錐孔反吹氣流量為150 L/h；碰撞氣流量為0.17 mL/min；霧化氣壓力為0.7 MPa。

圖1 50 μg/L標準品的提取離子流圖(EIC)Fig.1 Extracted ion chromatograms (EIC) ofDB standard solution at 50 μg/L

表2 DB及其內(nèi)標DB-D5質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of DB and theinternal standard,DB-D5

1.5 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

所有玻璃器皿用自來水超聲清洗30 min，用自來水清洗干凈后，再用純水洗3次，烘干后甲醇洗2次，待溶劑揮發(fā)完全后，置于馬弗爐中于450 ℃下燒3 h，自然冷卻后取出待用。

所有樣品在提取前添加回收率指示物標樣(DB-D5)，以指示整個樣品前處理過程的回收率。同時進行方法空白、基質(zhì)加標、基質(zhì)加標平行樣及樣品平行樣的測定，以進行質(zhì)量控制與質(zhì)量保證措施。

在每批樣品進行儀器分析前，用空白溶劑和已知濃度標樣檢查儀器的靈敏度和穩(wěn)定性，同一標樣測定的誤差小于20%方可進行樣品測定，否則對儀器進行調(diào)試。

根據(jù)歐盟有關違禁藥物檢測的條例規(guī)定(2002/657/EC)，為了保證目標化合物識別的準確性，采用如下2個標準:第一，樣品中色譜峰保留時間與標準物質(zhì)保留時間的相對偏差應在±2.5%以內(nèi)；第二，定性離子的相對豐度比與標準品溶液中的定性離子相對豐度比的相對偏差(K)不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在該目標物。

表3 定性離子相對豐度比的最大允許相對偏差Table 3 Maximum tolerance for the relative deviationsof the relative abundance of qualitative ions

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件比較

通過優(yōu)化固相萃取過程中的關鍵參數(shù)(SPE柱類型、水樣pH和洗脫溶劑種類)，來確定最佳SPE條件。

2.1.1 SPE柱類型選擇

由于DB屬于離子型有機物，其主要母體結(jié)構(gòu)帶正電。因此比較了2種陽離子交換機理的SPE柱(WCX和MCX)以及一種通用型SPE柱(HLB)，并控制上樣pH在8左右，洗脫劑為2%甲酸-甲醇。從結(jié)果來看，WCX柱(110%±5.6%)和MCX柱的提取效率(106%±4.5%)要明顯高于HLB柱的提取效率(75% ± 3.1%)?？紤]到實際樣品基質(zhì)對測量濃度存在一定的抑制作用(圖4)，為部分補償實際樣品測定過程中的基質(zhì)抑制效應，最終選擇WCX柱來富集水樣。

2.1.2 水樣pH優(yōu)化

水樣pH可以決定離子型有機物的帶電狀態(tài)和賦存形態(tài)，也可以影響SPE吸附劑的帶電狀態(tài)。比較pH 分別為 6、8和10條件下采用WCX柱富集和2%甲酸-甲醇洗脫時的回收率(圖2)，可以看出水樣pH=6時加標回收率為147%±19%，明顯超過100%；而水樣pH為8 ～ 10時對回收率結(jié)果的影響并不顯著(P> 0.05,單因素方差分析)，加標回收均能達到100%～110%。因此，最終選擇將上樣pH調(diào)至8以上。

圖2 不同提取條件下加標回收率比較Fig.2 Spiked recoveries of DB underdifferent SPE conditions

2.1.3 洗脫溶劑選擇

采用WCX柱進行洗脫溶劑選擇實驗，實驗中水樣pH調(diào)至8左右。洗脫溶劑對比了甲醇、2%甲酸-甲醇和2%(體積分數(shù)，下同)氨水-甲醇。圖2中表明，甲醇洗脫效率僅為25%±4.5% (n=3)；而往甲醇中加入2%甲酸或者氨水均能顯著提高DB的洗脫效率，但2%氨水-甲醇的洗脫效率遠大于100%，說明可能更多的基質(zhì)被同時洗脫下來。因此，最終選擇2%甲酸-甲醇作為最佳洗脫溶劑。

2.2 準確度、精密度與基質(zhì)效應

2.2.1 準確度

方法準確度是指使用該方法的測量結(jié)果與真實值的接近程度，一般用回收率表示。從圖3可以看出，純水中DB在不同加標水平下的加標回收率為97%～105%；珠江河水中DB在不同加標水平下的加標回收率為89%～119%?；厥章示?0%～120%之間，表明方法準確度較高，可以高效富集環(huán)境水體中的DB。

圖3 純水和珠江河水中不同加標水平下加標回收率及標準偏差Fig.3 Spiked recoveries and standarddeviations of DB in pure water and watersamples from the Pearl River atdifferent spiked levels

2.2.2 精確度

方法精密度是指在相同的實驗條件下對同一個均質(zhì)樣品多次取樣分析所測得結(jié)果之間的接近程度。一般用相對標準偏差(RSD，%)表示。純水和珠江河水中不同加標濃度下測量結(jié)果的RSD均小于7%，說明該方法的精密度較高。

2.2.3 基質(zhì)效應

基質(zhì)指樣品中被分析物以外的組分?；|(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準確性?；|(zhì)對分析結(jié)果的影響可以通過基質(zhì)效應(ME)來衡量[16]。污水處理廠進水和珠江河水樣品中不同加標濃度下基質(zhì)效應如圖4所示。

從圖4可以看出，DB在污水處理廠進水和河水樣品中的基質(zhì)效應(n=3)分別為-23.8%～-12.5%和-16.5% ～ -8.5%。ME均為負數(shù)，說明存在基質(zhì)抑制效應。污水處理廠進水樣品的基質(zhì)抑制效應相比河水樣品更大，尤其是在較低濃度時，可能是由于污水處理廠進水基質(zhì)相比河水更加復雜。而河水樣品的ME均小于20%，說明河水樣品對該方法的基質(zhì)干擾較小。

圖4 污水處理廠進水和珠江河水樣品中不同加標濃度下基質(zhì)效應Fig.4 Matrix effects of DB in water samplesfrom the influent of a WWTP and the PearlRiver at different spiked levels

2.3 方法檢出限與線性范圍

方法檢出限是指在特定基質(zhì)中對被分析物能進行可靠確認和定量的最低濃度，且其測定結(jié)果應有不低于90%的準確度。通過往7份200 mL空白水樣中加入0.1 ng目標物，經(jīng)過全過程分析，計算得到方法檢出限(MDL)[17]為0.07 ng/L，可滿足環(huán)境水體中痕量苯甲地那銨的檢測。

通過測量0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50 μg/L 9個質(zhì)量濃度梯度的標準品溶液，建立目標物的標準曲線(內(nèi)標質(zhì)量濃度為1 μg/L)。從圖5可以看出，標準曲線的相關系數(shù)r為0.999，說明DB在該濃度范圍內(nèi)有很好的線性。當DB質(zhì)量濃度為50 μg/L時，峰高為1.2 × 108，接近檢測器的飽和閾值；而當DB質(zhì)量濃度增加至100 μg/L時，發(fā)現(xiàn)檢測信號已經(jīng)發(fā)生飽和。如果樣品中DB的測量值超過50 μg/L時，可能需要對樣品濃度進行稀釋后重新測量。因此，DB的線性范圍為0.01 ～ 50 μg/L。

圖5 標準曲線Fig.5 Standard curve for DB

2.4 環(huán)境水樣測定

采用該方法測定了3份采集于珠江廣州城區(qū)段水樣中DB的濃度。結(jié)果表明DB在3份水樣中均被檢出，3次全過程重復分析結(jié)果分別為(2.8±0.4)、(5.7±0.2)、(4.7±0.2)ng/L。在顯著性水平α=0.05時計算的F值均小于臨界值，說明3組測量結(jié)果的精密度之間無顯著性差異。污水處理廠可能是環(huán)境中DB的主要來源[11]。因此，未來有必要研究DB在污水處理廠中的分布特征和去除情況。

3 結(jié)論

本文建立了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水中DB的方法，該方法準確度高、精密度好，基質(zhì)效應較小，方法檢出限可達痕量級別，可用于準確定量環(huán)境水體中的痕量DB。