梁潔，祁金麗，楊川川，胡玨，陳輝華，曹玉嬪，李耀華，孫正伊

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，南寧 530200；3.廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，南寧 530200；4.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530011)

廣西壯族自治區(qū)民間傳統(tǒng)的壯藥三七姜，收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》(第二卷)，為姜科(Zingiberaeeae)姜七屬植物土田七Stahlianthusinvolucratus(King ex Bak.) Craib.的塊根和根莖，又稱土田七、小田七、竹田七、毛七、姜三七等，分布于廣西、云南、廣東、福建等省區(qū)[1-2]。其性溫、味辛，具有散瘀、止痛、止血等功效，主要化學(xué)成分是揮發(fā)油，以塊根入藥，三七姜對跌打損傷、消腫止痛有明顯的療效，史書明確記載該藥材可散瘀消腫、活血止血、行氣止痛、跌打損傷等[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，三七姜對雌、孕激素負荷大鼠子宮肌瘤、子宮肌瘤患者血清中Bcl-2有一定的抑制作用[4-5]，誘導(dǎo)人鼻咽癌CNE-2細胞G1期阻滯、抑制細胞增殖[6]，有一定抗炎作用[7]。三七姜的化學(xué)成分有揮發(fā)油、黃酮類、皂苷、酚類、蒽醌類、植物甾醇、三萜、氨基酸、糖類和有機酸等[8-11]。文獻僅報道氣相色譜法建立三七姜揮發(fā)油指紋圖譜，筆者尚未見三七姜原兒茶酸、對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛含量測定及指紋圖譜相關(guān)研究報道。中藥質(zhì)量標志物(Q-Marker)是劉昌孝等[12]首次提出的從有效性、可測性等方面把控中藥質(zhì)量的新概念，藥效(功效) 是反映中藥有效性的本質(zhì)特征，原兒茶酸具有降血壓、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等功效[13]；對羥基苯甲酸具有抗炎和神經(jīng)保護的藥效[14]；對羥基苯甲醛具有抗血小板聚集、減輕神經(jīng)炎癥損傷等生物活性[15]。

遵循質(zhì)量標志物的原則，以上3種成分均與三七姜功效相關(guān)，將其確定為含測指標科學(xué)而合理。筆者選擇三七姜中原兒茶酸、對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛為指標，研究其含量測定方法和指紋圖譜，為三七姜藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore Simplicity-185超純水儀(美國密里博公司)；CPA225D型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，感量：0.01 mg)；FW-100高速萬能粉碎機(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)； TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)； RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2試藥 對照品原兒茶酸(批號：RP190605)、對羥基苯甲酸(批號：RP190609)、對羥基苯甲醛(批號：RP180913)、莪術(shù)二酮(批號：RP190405)，均由成都麥德生科技有限公司提供，對照品含量均>98.0%。甲醇、乙腈(美國 Fisher 公司，色譜純)，水為超純水，其他試劑均為分析純。10批藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定為姜科(Zingiberaeeae)姜七屬植物土田七Stahlianthusinvolucratus(King ex Bak.) Craib.的塊根和根莖。將藥材樣品粉碎，10批樣品的信息見表1。

表1 三七姜藥材樣品信息 Tab.1 Sample information of Stahlianthus involucratus

2 方法與結(jié)果

2.1供試品溶液的制備 稱取不同產(chǎn)地三七姜粗粉適量，加入8倍體積量的80%乙醇，加熱回流提取3次(每次2 h)，濾過并收集濾液，合并濾液，減壓濃縮，得到三七姜提取物。取三七姜提取物0.1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇5 mL超聲提取5 min，加甲醇定容，過濾，濾液13 000 r·min-1離心10 min(r=15.7 cm)，取上清液過孔徑0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2對照品溶液的制備 取莪術(shù)二酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含莪術(shù)二酮0.2 mg的對照品溶液備用。另取原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含原兒茶酸0.023 6 mg、對羥基苯甲酸0.021 2 mg、對羥基苯甲醛0.014 9 mg的混合對照品溶液備用。

2.3高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜建立

2.3.1色譜條件 Phenomenex Kinetex XB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長為220 nm，柱溫35 ℃，進樣量15 μL。以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動相進行梯度洗脫(0～10 min，30%～50%A；10～40 min，50%～75%A；40～60 min，75%～95%A；60～70 min，95%～100%A)，流速0.8 mL·min-1。

2.3.2精密度實驗 取三七姜(S1)適量，按上法制備供試品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，以4號峰(莪術(shù)二酮)為參照峰，記錄HPLC圖，結(jié)果各色譜峰相對保留時間RSD 0.06%～0.14%，相對峰面積的RSD 0.59%～1.94%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性實驗 取三七姜(S1)供試品溶液，按上述的色譜條件分別在0，2，4，8，16，24 h進行檢測，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD0.15%～0.34%，相對峰面積的RSD1.53%～2.91%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性實驗 取三七姜(S1)適量，平行制備供試品溶液6份，依法進樣測定，記錄 HPLC 圖，考察實驗方法的重復(fù)性。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD0.15%～0.36%，相對峰面積的RSD 1.33%～2.61%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5指紋圖譜建立 分別取三七姜藥材10批，按“2.1”項方法制備供試品溶液， 在“2.3”項色譜條件進樣15 μL測定，所得色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.1版)，采用中位數(shù)法，時間寬度0.1 min，自動匹配生成10批三七姜藥材的指紋圖譜和對照圖譜 (圖1)。

圖1 10批不同產(chǎn)地三七姜藥材指紋圖譜 Fig.1 Fingerprints of ten batches of Stahlianthus involucratus from different origins

2.3.6色譜峰歸屬 通過自動匹配，系統(tǒng)依據(jù)三七姜藥材的共有模式， 生成對照指紋圖譜， 確定了16個共有峰，作為三七姜藥材特征峰。其中4號峰(莪術(shù)二酮)穩(wěn)定性好，色譜響應(yīng)值較高，保留時間較為適中，故選擇4號峰(莪術(shù)二酮)作為參照峰。

2.3.7相似度分析 本實驗借助國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.1版》軟件，對10批三七姜藥材的指紋圖譜進行相似度計算，相似度分別為：0.988，0.979，0.987，0.989，0.993，0.973，0.994，0.989，0.929，0.990。表明該藥材各批次間共有成分基本一致，但批次間各成分含有量存在一定差異。

2.3.8聚類分析 運用聚類分析對三七姜藥材的指紋圖譜進行分析，將10批樣品的共有峰峰面積為變量，運用SPSS 21.0版軟件對10批三七姜藥材進行聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以歐氏距離(Euclidean distance)作為樣品的度量標準，對10批三七姜藥材的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當歐氏距離為15時，10批三七姜藥材大致分為三類：第一類：S1、S3、S4、S5、S7、S8、S10，第二類：S2、S6，第三類：S9。

圖2 10批三七姜藥材的聚類分析 Fig.2 Cluster analysis of ten batches of Stahlianthus involucratus

2.3.9主成分分析 將三七姜樣品S1～S10 的共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 21.0版軟件進行主成分分析，從16個變量中共提取3個主成分，累計方差貢獻率達93.875%，其中第一主成分方差貢獻率為59.016%，第二主成分方差貢獻率為24.307%，第三主成分方差貢獻率為10.552%，能比較全面地反映樣品的信息。因此，以第一、二、三主成分的空間散點坐標系建立3D分布圖，得到10批樣品的主成分分析空間得分圖，見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可將10批不同產(chǎn)地的三七姜藥材大致分為三類：其中S9為第一大類、S2、S6為第二大類、S1、S3、S4、S5、S7、S8、S10為第三大類。其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 10批三七姜藥材的PCA得分散點圖 Fig.3 PCA score scatter plot of ten batches of Stahlianthus involucratus

2.4原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛含量測定

2.4.1色譜條件 Syncronis C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長為260 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動相進行梯度洗脫(0～10 min，15%～18%A；10～15 min，18%A；15～20 min，18%～20%A)，流速0.8 mL·min-1。

2.4.2專屬性實驗 精密吸取混合對照品溶液和三七姜供試品溶液(S1)，按照“2.4.1”項下的色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖4，三七姜供試品溶液與混合對照品中的原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛相對保留時間基本相同，供試品溶液色譜圖中，原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛與相鄰峰分離度>1.5，符合要求，說明該法具有良好的專屬性。

1.原兒茶酸；2.對羥基苯甲酸；3.對羥基苯甲醛。圖4 三七姜樣品和混合對照品HPLC圖譜 1.protocatechuic acid；2.p-hydroxybenzoic acid；3.p-hydroxybenzaldehyde.Fig.4 HPLC chromatograms of Stahlianthus involucratus sample and mixed reference substances

2.4.3線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項下的對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶液制成一系列濃度的對照品溶液，依法進樣測定，記錄3種成分的峰面積，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行回歸，繪制標準工作曲線。得到原兒茶酸的標準曲線為Y=35 348.317 1X+0.913 4，r=0.999 91(n=6)，在2.36～16.52 μg·mL-1內(nèi)線性范圍良好；對羥基苯甲酸的標準曲線為Y=59 585.950 2X-0.624 4，r=0.999 97(n=6)，在2.12～14.84 μg·mL-1的線性關(guān)系良好；對羥基苯甲醛的標準曲線為Y=38 373.962 3X-0.59，r=0.999 98(n=6)；在1.49～10.43 μg·mL-1的線性關(guān)系良好。

2.4.4精密度考察 按“2.2”項下的混合對照品溶液，按“2.4.1”項下的色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定其峰面積，測得原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛峰面積的RSD值分別為0.30%，0.35%，0.57%，表明儀器精密度良好。

2.4.5穩(wěn)定性考察 取同一批供試品溶液(S1)，按“2.4.1”項下色譜條件，分別于0，4，8，12，16，24 h測定，記錄色譜圖，測得原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的峰面積RSD分別為1.49%，1.56%，1.50%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6重復(fù)性考察 用同一產(chǎn)地三七姜藥材(S1)6份，按“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下的色譜條件測定，記錄原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的峰面積，計算各成分含量，結(jié)果3種成分含量的RSD分別為0.77%，1.11%，1.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7加樣回收實驗 精密稱取已知含量的三七姜藥材(S1)6份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入“2.2”項下的混合對照品溶液適量，按照“2.1”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項下的色譜條件測定峰面積，計算供試品中原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的平均回收率分別為101.50%，101.54%，100.67%，RSD分別為1.85%，1.81%，1.54%，結(jié)果見表2。

表2 供試品中3種成分加樣回收率實驗結(jié)果 Tab.2 Recovery rate experimental results of three components in the test sample n=6

2.5樣品含量測定 取不同產(chǎn)地的三七姜樣品10個批次，每個批次平行制備供試品溶液3份，依法進樣測定，記錄原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛3種成分的峰面積，并計算各成分的含量(表3)。

表3 不同產(chǎn)地的三七姜含量測定結(jié)果 Tab.3 Content determination results of Stahlianthus involucratus from different origins mg·g-1，n=3

3 討論

指紋圖譜研究中，分別比較COSMOSIL 5 C18-PAQ(4.6 mm×250 mm，5 μm)、依利特ODS-2 HYPERSIL(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex Kinetex XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)3種色譜柱，Phenomenex Kinetex XB-C18對各成分的分離效果及峰型較好，基線較平，保留時間適當，故選擇該色譜柱。分別對甲醇-0.1%磷酸、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%冰醋酸不同的流動相系統(tǒng)進行了考察，結(jié)果顯示乙腈-0.1%磷酸的分離度較好。分別考察了220，256，280，300，340 nm 5個波長的色譜圖，結(jié)果表明，在220 nm處顯示較多的峰信息，各峰型較好、基線平穩(wěn)，因此選擇220 nm作為檢測波長。分別考察了20，25，30，35 ℃不同柱溫下的色譜圖，結(jié)果表明柱溫在35 ℃時，各峰分離效果較好?？疾炝?.8，1.0，1.2 mL·min-1不同流速下的色譜圖。結(jié)果表明流速在0.8 mL·min-1時，各峰分離效果較好。分別對5，10，15 μL不同進樣量進行了考察，結(jié)果表明，15 μL的圖譜峰面積較適合，故采用15 μL作為進樣量。

含量測定結(jié)果可知10個產(chǎn)地的三七姜的藥材均含有原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛這3種成分，但不同產(chǎn)地的三七姜藥材中原兒茶酸、對羥基苯甲酸以及對羥基苯甲醛的含量存在差異，其中產(chǎn)地S8中原兒茶酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛含量較高，而產(chǎn)地S2含量較低。推測造成這樣差異的原因可能與藥材生長的環(huán)境、氣候、采收季節(jié)等因素有關(guān)。指紋圖譜研究表明10批三七姜相似度>0.9，均符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》規(guī)定。運用SPSS21.0版軟件對10批不同產(chǎn)地三七姜提取物指紋圖譜進行聚類分析和主成分分析，結(jié)果得到聚類分析和主成分分析結(jié)果相一致。藥材中的某些元素及含量與生長地經(jīng)緯度、海拔以及土壤密切相關(guān)[16]。本文三七姜第一類S2、S6的經(jīng)度分別為110°28′E，110°14′E，這2個產(chǎn)地經(jīng)度相近可將其歸為一類；第二類S9經(jīng)緯度為107°37′E，22°42′N該產(chǎn)地與其他9個產(chǎn)地的經(jīng)緯度相差較遠故歸為一類；第三類S1、S3、S4、S5、S7、S8、S10的緯度分布在22°84′N～24°70′N之間，這7個產(chǎn)地之間的緯度相近可將其歸為一類，10批不同產(chǎn)地三七姜分為三類，存在差異的原因推測可能受地理因素經(jīng)緯度的影響，更多的影響因素及全國其他地區(qū)的藥材有待進一步廣泛的收集與研究，確保其建立指紋圖譜的廣泛性和特征性，為其今后深入地研究與開發(fā)利用提供有力的科學(xué)支撐。本實驗采用 HPLC 法研究三七姜指紋圖譜和含量測定方法，可為三七姜質(zhì)量控制提供參考。