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        木犀草素與哌嗪共晶的表征及初步藥動(dòng)學(xué)研究*

        2022-04-27 03:08:56燕柳艷生立嵩宋俊科楊德智張麗呂揚(yáng)王守寶杜冠華
        醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2022年5期
        關(guān)鍵詞:哌嗪草素木犀

        燕柳艷,生立嵩,3,宋俊科,楊德智,張麗,呂揚(yáng),王守寶,杜冠華

        (1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050;3.山東省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究所中藥制劑研究室,濟(jì)南 250014)

        共晶是指2種或2種以上不同分子通過(guò)非共價(jià)相互作用力而處于同一晶格內(nèi)的固體存在形式,既可以是藥物-藥物的組合,也可以是藥物-化學(xué)小分子的組合,共晶技術(shù)是改善藥物理化性質(zhì)、提高成藥性的有效手段[1]。藥物形成共晶后化學(xué)結(jié)構(gòu)不受影響,但理化性質(zhì)得到改善[2-3]。藥物共晶作為一種改善藥物成藥性的有效手段已引起廣大藥學(xué)研究者的關(guān)注[4-6]。藥物共晶的性質(zhì)與藥學(xué)研究不斷有新穎和深入的發(fā)現(xiàn),熊果酸-乙醇共晶[7]以及加入十二烷基硫酸鈉灌胃給藥后熊果酸在大鼠體內(nèi)的生物利用度顯著提高。在抗菌藥物共晶中[2],磺胺噻唑與苯巴比妥酸共晶可大大提高抗菌活性,使前者活性提高2倍以上。ARAUJO等[8]報(bào)道了氟苯咪唑的多個(gè)共晶,通過(guò)共晶改善了氟苯咪唑的溶解度,并因此提高了其體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)和吸收速率。因此,作為醫(yī)藥研究領(lǐng)域與藥物晶體學(xué)工程研究的新興交叉學(xué)科,藥物共晶研究具有相當(dāng)廣闊的前景。

        木犀草素是一種四羥基黃酮類化合物,存在于自然界多種植物當(dāng)中,是一種廣泛存在且具有藥用價(jià)值的化合物。研究發(fā)現(xiàn),木犀草素具有多種藥理學(xué)作用,包括抗腫瘤[9-15]、抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等[10-11]。作為典型的黃酮類化合物,木犀草素有多個(gè)酚羥基基團(tuán)作為氫鍵供體,有較好的形成共晶條件,因此將其與哌嗪進(jìn)行共晶研究,旨在探討提高木犀草素生物利用度的方法,以提高木犀草素的成藥性。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD大鼠,雄性,體質(zhì)量180~220 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。 大鼠分籠飼養(yǎng),自由飲食,飼養(yǎng)室溫度(25±2) ℃,相對(duì)濕度(60±5)%,光暗周期同晝夜周期。

        1.2藥品與試劑 木犀草素由陜西惠科植物開發(fā)有限公司生產(chǎn)(批號(hào):20121016,含量≥96.0%);哌嗪由北京偶聯(lián)科技有限公司生產(chǎn)(批號(hào):20170226,含量≥95.0%);木犀草素與哌嗪共晶及同比例混合物均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物晶型研究中心晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

        1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Rigaku Smartlab 粉末X 射線衍射儀(日本Rigaku 公司);Mettler Toledo DSC 差示掃描量熱儀(瑞士Mettler Toledo 公司);Five Easy 型pH 計(jì)(瑞士Mettler Toledo 公司);Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司);XS 105 Dual Range 型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司,感量:0.01 mg);Agilent 1200系列液相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀(G1379B在線脫氣機(jī),G1311A四元梯度泵,G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器,G1315DDAD檢測(cè)器及系統(tǒng)控制器,G1316A柱溫箱,6110單四級(jí)桿質(zhì)譜儀,ESI離子源,Agilent公司,美國(guó));Allegra TMX-22R全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(Beckman公司,美國(guó));Vortex-Genie 2 漩渦混勻器(上海凡勁儀器設(shè)備有限公司);Organomation N-EVAP 系列氮吹儀(Organomation公司,美國(guó));固體灌胃器(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國(guó)家藥物篩選中心研制);Eppendorf 移液器(Eppendorf 公司,德國(guó))等。

        1.4粉末X射線衍射(powder X-ray diffraction,PXRD)條件 CuKα 輻射,石墨單色器,管壓40 kV,管流150 mA,2θ 掃描范圍3°~40°,掃描速度8°·min-1,步長(zhǎng)0.02°,發(fā)散狹縫DS=1°,接收狹縫為RS=0.15 mm,防散射狹縫為SS=1°。

        1.5差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)熱分析條件 樣品量3~10 mg,精密稱定。以空鋁坩堝作為參比,氮?dú)?N2)氣氛 50 mL·min-1,掃描溫度范圍:30~350 ℃,升溫速率:10 ℃·min-1。

        1.6樣品制備方法 共晶制備方法:精密稱取木犀草素286.2 mg,哌嗪172.3 mg(摩爾比1:2)混合均勻,加入乙酸乙酯0.5 mL,輕輕研磨直至溶劑揮干,即得。物理混合物制備方法:按摩爾比1:2精密稱取木犀草素和哌嗪,混合均勻,即得。

        1.7色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱Agilent SB-C18,柱溫30 ℃。流動(dòng)相,梯度洗脫:0~10 min,乙腈:0.1%甲酸=25:75(V/V);10~14 min,乙腈:0.1%甲酸=80:20(V/V);14~17 min,乙腈:0.1%甲酸=25:75(V/V),流速0.3 m L·min-1,進(jìn)樣量:10 μL,測(cè)定時(shí)間:17 min。質(zhì)譜信號(hào):ESI源(負(fù)離子檢測(cè)模式),用于定量分析的離子荷質(zhì)比為269.10與285.00(木犀草素),增益系數(shù)為2.0,干燥氣流為10.0 L·min-1,噴霧室電壓為241.3 kPa,干燥器溫度為 350 ℃。

        1.8血漿樣品的采集與處理 取雄性SD大鼠,隨機(jī)分組,每組3只,動(dòng)物自由飲水,禁食12 h后,根據(jù)設(shè)計(jì)于上午9:00按相同劑量固體灌胃給予木犀草素哌嗪共晶以及同比例物理混合物。給藥5,15,30,45 min,1,1.5,2,3,6,9,12 h,眼齜內(nèi)靜脈叢取血約0.4 mL,至肝素化抗凝管,4 ℃、5000 r·min-1離心10 min(r=6 cm)。精密吸取肝素抗凝血漿100 μL,置于1.5 mL離心管中,加入乙酸乙酯1.2 mL萃取,充分震蕩5 min,離心(13 000 r·min-1,r=6 cm,10 min)。取上層溶液100 μL于離心管中,常溫下以N2吹干。加入乙腈100 μL復(fù)溶,震蕩3 min,離心(13 000 r·min-1,r=6 cm,5 min),取上層溶液50 μL于內(nèi)襯管中,進(jìn)樣10 μL。

        2 結(jié)果

        2.1木犀草素與哌嗪共晶的表征

        2.1.1PXRD分析 PXRD分析法可用于不同晶型物質(zhì)鑒別,是木犀草素與哌嗪共晶的的有效分析方法,共晶和單一哌嗪、木犀草素的PXRD圖譜在衍射峰數(shù)量、衍射峰位置、衍射峰強(qiáng)度、衍射峰拓?fù)鋱D形等方面均存在明顯差異,表明木犀草素與哌嗪共晶和單一哌嗪與木犀草素既不相同也不等同,證明了共晶形成,圖譜見(jiàn)圖1。

        A.哌嗪;B.木犀草素;C.木犀草素與哌嗪共晶。圖1 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的PXRD圖譜 A.piperazine;B.luteolin;C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.1 PXRD patterns of piperazine,luteolin and their cocrystal

        2.1.2DSC分析 DSC法是一種熱分析法。該方法測(cè)量的是在程序控制溫度下,測(cè)量輸入到試樣和參比物的功率差與溫度的關(guān)系。由圖2可知,哌嗪、木犀草素及共晶的吸熱峰分別為112.7,335.3,236.8 ℃,木犀草素和哌嗪熔融峰較尖銳,而共晶在相應(yīng)溫度下熔融峰完全消失,說(shuō)明晶型發(fā)生改變。

        A.哌嗪;B.木犀草素;C.木犀草素與哌嗪共晶。圖2 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的DSC圖譜 A.piperazine;B.luteolin;C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.2 DSC curves of piperazine,luteolin and their cocrystal

        2.1.3紅外光譜分析 采用紅外光譜法對(duì)木犀草素、哌嗪及共晶進(jìn)行表征,其紅外吸收光譜如圖3所示。分析結(jié)果表明,在3500,1250 cm-1附近,共晶與單一木犀草素、哌嗪的紅外振動(dòng)光譜存在明顯差異。

        A.哌嗪; B.木犀草素; C.木犀草素與哌嗪共晶。圖3 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的ATR-FTIR圖譜 A.piperazine; B.luteolin; C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.3 ATR-FTIR patterns of piperazine,luteolin and their cocrystal

        2.2溶解性 為了驗(yàn)證晶型狀態(tài)與晶型溶解性質(zhì)的關(guān)系,對(duì)木犀草素、哌嗪及共晶進(jìn)行溶解性質(zhì)評(píng)價(jià)。參照溶解度測(cè)定方法[16]測(cè)定。采用高效液相色譜法,利用樣品的色譜峰面積數(shù)據(jù)對(duì)樣品溶解的濃度進(jìn)行計(jì)算,以時(shí)間為橫坐標(biāo),溶劑濃度為縱坐標(biāo)分別繪制溶解度曲線,溶解性數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4。比較后發(fā)現(xiàn),共晶可改善木犀草素的溶解性,在0.5%十二烷基硫酸鈉溶出介質(zhì)中,共晶的溶出度較物理混合物提高39%,溶出度最大達(dá)到83.1%。

        A.水;B.0.5%十二烷基硫酸鈉溶液。圖4 木犀草素與哌嗪共晶、物理混合物及單一木犀草素在2種溶出介質(zhì)中的溶出曲線圖 A.water;B.0.5% sodium dodecyl sulfate solution.Fig.4 Dissolution curves of luteolin and piperazine cocrystal,physical mixture and luteolin in two dissolution media

        2.3專屬性 按照“1.7”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),木犀草素的保留時(shí)間為7.0 min,在空白血漿相應(yīng)位置處無(wú)吸收峰,說(shuō)明該方法具有專屬性。結(jié)果見(jiàn)圖5。

        A.空白血漿;B.空白血漿+共晶樣品; C.大鼠口服共晶5 min后血漿樣品。圖5 血漿樣品的LC-MS圖 A. blank plasma;B.blank plasma mixed with cocrystal;C.rat plasma which were taken 5 min after oral cocrystal.Fig.5 LC-MS chromatograms of plasma samples

        2.4藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

        2.4.1血藥濃度-時(shí)間曲線 共晶和物理混合物口服后在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖6。共晶各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血藥濃度均高于物理混合物,共晶的血藥濃度-時(shí)間曲線在100 min左右出現(xiàn)峰值,物理混合物的血藥濃度-時(shí)間曲線在350 min左右出現(xiàn)峰值,說(shuō)明共晶較物理混合物達(dá)峰時(shí)間早,且血藥濃度高。說(shuō)明共晶吸收速度快并且生物利用度高。

        圖6 共晶及物理混合物血藥濃度-時(shí)間曲線±s,n=3)Fig.6 Mean plasma concentration-time curves of cocrystal and physical ±s,n=3)

        2.4.2共晶及物理混合物在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 木犀草素與哌嗪共晶以及同比例物理混合物的藥

        代參數(shù)如表1所示,共晶的達(dá)峰時(shí)間(tmax)明顯小于物理混合物,血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)大于物理混合物(P<0.05),說(shuō)明共晶可使木犀草素更快達(dá)到合適的血藥濃度,提高木犀草素的生物利用度。其他代謝參數(shù)與物理混合物也存在差異,如共晶在體內(nèi)滯留時(shí)間短于物理混合物。

        表1 大鼠灌胃給藥后非房室模型藥動(dòng)學(xué)參數(shù) Tab.1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of rats after intragastric administration ±s,n=3

        3 討論

        藥物共晶是在不改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提下,理化性質(zhì)得到改善的一種強(qiáng)有力的方法。木犀草素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等良好的藥理活性,但是成藥性差,最重要的原因之一就是溶解度等理化性質(zhì)差、生物利用度差,最終影響在體吸收過(guò)程,這是影響藥理活性的關(guān)鍵,藥物在體吸收濃度直接影響藥物的有效性和安全性,因此,尋找提高生物利用度的方法尤其重要。近年來(lái),對(duì)于溶解性的改善方面的研究很多,主要是將藥物做成包合物[17],結(jié)構(gòu)修飾做成前藥[18]。本文通過(guò)共晶的方式明顯改善了木犀草素的溶解性差的問(wèn)題。

        木犀草素多個(gè)羥基基團(tuán)為其形成共晶創(chuàng)造了良好的條件,本研究采用化學(xué)小分子哌嗪進(jìn)行共晶結(jié)合,制備后通過(guò)不同方法進(jìn)行表征,發(fā)現(xiàn)PXRD、紅外光譜分析與DSC均能有效鑒別共晶與物理混合物。通過(guò)溶解性實(shí)驗(yàn)觀察到在0.5%十二烷基硫酸鈉溶劑系統(tǒng)中,共晶溶解度較物理混合物有重要提高,這對(duì)生物利用度的提高有重要意義。

        同時(shí),大鼠初步體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示,與物理混合物相比,共晶固體口服給藥在大鼠體內(nèi)的峰濃度大于物理混合物,且達(dá)峰時(shí)間明顯縮短,證明共晶能迅速發(fā)揮治療作用,具有更好的臨床應(yīng)用前景。

        藥物共晶研究對(duì)于新藥的開發(fā)以及現(xiàn)有藥物的優(yōu)化都十分重要。木犀草素是一種黃酮類化合物,哌嗪是一種化學(xué)小分子,一種生物活性較強(qiáng)的物質(zhì)與一種并無(wú)明確藥效作用的物質(zhì)結(jié)合,其藥理作用是否會(huì)進(jìn)一步發(fā)生改變,還有待深入研究發(fā)掘。

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