燕柳艷，生立嵩，3，宋俊科，楊德智，張麗，呂揚(yáng)，王守寶，杜冠華

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；3.山東省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究所中藥制劑研究室，濟(jì)南 250014)

共晶是指2種或2種以上不同分子通過(guò)非共價(jià)相互作用力而處于同一晶格內(nèi)的固體存在形式，既可以是藥物-藥物的組合，也可以是藥物-化學(xué)小分子的組合，共晶技術(shù)是改善藥物理化性質(zhì)、提高成藥性的有效手段[1]。藥物形成共晶后化學(xué)結(jié)構(gòu)不受影響，但理化性質(zhì)得到改善[2-3]。藥物共晶作為一種改善藥物成藥性的有效手段已引起廣大藥學(xué)研究者的關(guān)注[4-6]。藥物共晶的性質(zhì)與藥學(xué)研究不斷有新穎和深入的發(fā)現(xiàn)，熊果酸-乙醇共晶[7]以及加入十二烷基硫酸鈉灌胃給藥后熊果酸在大鼠體內(nèi)的生物利用度顯著提高。在抗菌藥物共晶中[2]，磺胺噻唑與苯巴比妥酸共晶可大大提高抗菌活性，使前者活性提高2倍以上。ARAUJO等[8]報(bào)道了氟苯咪唑的多個(gè)共晶，通過(guò)共晶改善了氟苯咪唑的溶解度，并因此提高了其體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)和吸收速率。因此，作為醫(yī)藥研究領(lǐng)域與藥物晶體學(xué)工程研究的新興交叉學(xué)科，藥物共晶研究具有相當(dāng)廣闊的前景。

木犀草素是一種四羥基黃酮類化合物，存在于自然界多種植物當(dāng)中，是一種廣泛存在且具有藥用價(jià)值的化合物。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有多種藥理學(xué)作用，包括抗腫瘤[9-15]、抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等[10-11]。作為典型的黃酮類化合物，木犀草素有多個(gè)酚羥基基團(tuán)作為氫鍵供體，有較好的形成共晶條件，因此將其與哌嗪進(jìn)行共晶研究，旨在探討提高木犀草素生物利用度的方法，以提高木犀草素的成藥性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。 大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，飼養(yǎng)室溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度(60±5)%，光暗周期同晝夜周期。

1.2藥品與試劑 木犀草素由陜西惠科植物開發(fā)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20121016，含量≥96.0%)；哌嗪由北京偶聯(lián)科技有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20170226，含量≥95.0%)；木犀草素與哌嗪共晶及同比例混合物均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物晶型研究中心晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Rigaku Smartlab 粉末X 射線衍射儀(日本Rigaku 公司)；Mettler Toledo DSC 差示掃描量熱儀(瑞士Mettler Toledo 公司)；Five Easy 型pH 計(jì)(瑞士Mettler Toledo 公司)；Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；XS 105 Dual Range 型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)；Agilent 1200系列液相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀(G1379B在線脫氣機(jī)，G1311A四元梯度泵，G1329A 自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315DDAD檢測(cè)器及系統(tǒng)控制器，G1316A柱溫箱，6110單四級(jí)桿質(zhì)譜儀，ESI離子源，Agilent公司，美國(guó))；Allegra TMX-22R全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(Beckman公司，美國(guó))；Vortex-Genie 2 漩渦混勻器(上海凡勁儀器設(shè)備有限公司)；Organomation N-EVAP 系列氮吹儀(Organomation公司，美國(guó))；固體灌胃器(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國(guó)家藥物篩選中心研制)；Eppendorf 移液器(Eppendorf 公司，德國(guó))等。

1.4粉末X射線衍射(powder X-ray diffraction，PXRD)條件 CuKα 輻射，石墨單色器，管壓40 kV，管流150 mA，2θ 掃描范圍3°～40°，掃描速度8°·min-1，步長(zhǎng)0.02°，發(fā)散狹縫DS=1°，接收狹縫為RS=0.15 mm，防散射狹縫為SS=1°。

1.5差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)熱分析條件 樣品量3～10 mg，精密稱定。以空鋁坩堝作為參比，氮?dú)?N2)氣氛 50 mL·min-1，掃描溫度范圍：30～350 ℃，升溫速率：10 ℃·min-1。

1.6樣品制備方法 共晶制備方法：精密稱取木犀草素286.2 mg，哌嗪172.3 mg(摩爾比1：2)混合均勻，加入乙酸乙酯0.5 mL，輕輕研磨直至溶劑揮干，即得。物理混合物制備方法：按摩爾比1：2精密稱取木犀草素和哌嗪，混合均勻，即得。

1.7色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱Agilent SB-C18，柱溫30 ℃。流動(dòng)相，梯度洗脫：0～10 min，乙腈：0.1%甲酸=25：75(V/V)；10～14 min，乙腈：0.1%甲酸=80：20(V/V)；14～17 min，乙腈：0.1%甲酸=25：75(V/V)，流速0.3 m L·min-1，進(jìn)樣量：10 μL，測(cè)定時(shí)間：17 min。質(zhì)譜信號(hào)：ESI源(負(fù)離子檢測(cè)模式)，用于定量分析的離子荷質(zhì)比為269.10與285.00(木犀草素)，增益系數(shù)為2.0，干燥氣流為10.0 L·min-1，噴霧室電壓為241.3 kPa，干燥器溫度為 350 ℃。

1.8血漿樣品的采集與處理 取雄性SD大鼠，隨機(jī)分組，每組3只，動(dòng)物自由飲水，禁食12 h后，根據(jù)設(shè)計(jì)于上午9：00按相同劑量固體灌胃給予木犀草素哌嗪共晶以及同比例物理混合物。給藥5，15，30，45 min，1，1.5，2，3，6，9，12 h，眼齜內(nèi)靜脈叢取血約0.4 mL，至肝素化抗凝管，4 ℃、5000 r·min-1離心10 min(r=6 cm)。精密吸取肝素抗凝血漿100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入乙酸乙酯1.2 mL萃取，充分震蕩5 min，離心(13 000 r·min-1，r=6 cm，10 min)。取上層溶液100 μL于離心管中，常溫下以N2吹干。加入乙腈100 μL復(fù)溶，震蕩3 min，離心(13 000 r·min-1，r=6 cm，5 min)，取上層溶液50 μL于內(nèi)襯管中，進(jìn)樣10 μL。

2 結(jié)果

2.1木犀草素與哌嗪共晶的表征

2.1.1PXRD分析 PXRD分析法可用于不同晶型物質(zhì)鑒別，是木犀草素與哌嗪共晶的的有效分析方法，共晶和單一哌嗪、木犀草素的PXRD圖譜在衍射峰數(shù)量、衍射峰位置、衍射峰強(qiáng)度、衍射峰拓?fù)鋱D形等方面均存在明顯差異，表明木犀草素與哌嗪共晶和單一哌嗪與木犀草素既不相同也不等同，證明了共晶形成，圖譜見(jiàn)圖1。

A.哌嗪；B.木犀草素；C.木犀草素與哌嗪共晶。圖1 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的PXRD圖譜 A.piperazine；B.luteolin；C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.1 PXRD patterns of piperazine，luteolin and their cocrystal

2.1.2DSC分析 DSC法是一種熱分析法。該方法測(cè)量的是在程序控制溫度下，測(cè)量輸入到試樣和參比物的功率差與溫度的關(guān)系。由圖2可知，哌嗪、木犀草素及共晶的吸熱峰分別為112.7，335.3，236.8 ℃，木犀草素和哌嗪熔融峰較尖銳，而共晶在相應(yīng)溫度下熔融峰完全消失，說(shuō)明晶型發(fā)生改變。

A.哌嗪；B.木犀草素；C.木犀草素與哌嗪共晶。圖2 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的DSC圖譜 A.piperazine；B.luteolin；C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.2 DSC curves of piperazine，luteolin and their cocrystal

2.1.3紅外光譜分析 采用紅外光譜法對(duì)木犀草素、哌嗪及共晶進(jìn)行表征，其紅外吸收光譜如圖3所示。分析結(jié)果表明，在3500，1250 cm-1附近，共晶與單一木犀草素、哌嗪的紅外振動(dòng)光譜存在明顯差異。

A.哌嗪； B.木犀草素； C.木犀草素與哌嗪共晶。圖3 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的ATR-FTIR圖譜 A.piperazine； B.luteolin； C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.3 ATR-FTIR patterns of piperazine，luteolin and their cocrystal

2.2溶解性 為了驗(yàn)證晶型狀態(tài)與晶型溶解性質(zhì)的關(guān)系，對(duì)木犀草素、哌嗪及共晶進(jìn)行溶解性質(zhì)評(píng)價(jià)。參照溶解度測(cè)定方法[16]測(cè)定。采用高效液相色譜法，利用樣品的色譜峰面積數(shù)據(jù)對(duì)樣品溶解的濃度進(jìn)行計(jì)算，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，溶劑濃度為縱坐標(biāo)分別繪制溶解度曲線，溶解性數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4。比較后發(fā)現(xiàn)，共晶可改善木犀草素的溶解性，在0.5%十二烷基硫酸鈉溶出介質(zhì)中，共晶的溶出度較物理混合物提高39%，溶出度最大達(dá)到83.1%。

A.水；B.0.5%十二烷基硫酸鈉溶液。圖4 木犀草素與哌嗪共晶、物理混合物及單一木犀草素在2種溶出介質(zhì)中的溶出曲線圖 A.water；B.0.5% sodium dodecyl sulfate solution.Fig.4 Dissolution curves of luteolin and piperazine cocrystal，physical mixture and luteolin in two dissolution media

2.3專屬性 按照“1.7”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，木犀草素的保留時(shí)間為7.0 min，在空白血漿相應(yīng)位置處無(wú)吸收峰，說(shuō)明該方法具有專屬性。結(jié)果見(jiàn)圖5。

A.空白血漿；B.空白血漿+共晶樣品； C.大鼠口服共晶5 min后血漿樣品。圖5 血漿樣品的LC-MS圖 A. blank plasma；B.blank plasma mixed with cocrystal；C.rat plasma which were taken 5 min after oral cocrystal.Fig.5 LC-MS chromatograms of plasma samples

2.4藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

2.4.1血藥濃度-時(shí)間曲線 共晶和物理混合物口服后在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖6。共晶各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血藥濃度均高于物理混合物，共晶的血藥濃度-時(shí)間曲線在100 min左右出現(xiàn)峰值，物理混合物的血藥濃度-時(shí)間曲線在350 min左右出現(xiàn)峰值，說(shuō)明共晶較物理混合物達(dá)峰時(shí)間早，且血藥濃度高。說(shuō)明共晶吸收速度快并且生物利用度高。

圖6 共晶及物理混合物血藥濃度-時(shí)間曲線±s，n=3)Fig.6 Mean plasma concentration-time curves of cocrystal and physical ±s，n=3)

2.4.2共晶及物理混合物在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 木犀草素與哌嗪共晶以及同比例物理混合物的藥

代參數(shù)如表1所示，共晶的達(dá)峰時(shí)間(tmax)明顯小于物理混合物，血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)大于物理混合物(P<0.05)，說(shuō)明共晶可使木犀草素更快達(dá)到合適的血藥濃度，提高木犀草素的生物利用度。其他代謝參數(shù)與物理混合物也存在差異，如共晶在體內(nèi)滯留時(shí)間短于物理混合物。

表1 大鼠灌胃給藥后非房室模型藥動(dòng)學(xué)參數(shù) Tab.1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of rats after intragastric administration ±s，n=3

3 討論

藥物共晶是在不改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提下，理化性質(zhì)得到改善的一種強(qiáng)有力的方法。木犀草素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等良好的藥理活性，但是成藥性差，最重要的原因之一就是溶解度等理化性質(zhì)差、生物利用度差，最終影響在體吸收過(guò)程，這是影響藥理活性的關(guān)鍵，藥物在體吸收濃度直接影響藥物的有效性和安全性，因此，尋找提高生物利用度的方法尤其重要。近年來(lái)，對(duì)于溶解性的改善方面的研究很多，主要是將藥物做成包合物[17]，結(jié)構(gòu)修飾做成前藥[18]。本文通過(guò)共晶的方式明顯改善了木犀草素的溶解性差的問(wèn)題。

木犀草素多個(gè)羥基基團(tuán)為其形成共晶創(chuàng)造了良好的條件，本研究采用化學(xué)小分子哌嗪進(jìn)行共晶結(jié)合，制備后通過(guò)不同方法進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)PXRD、紅外光譜分析與DSC均能有效鑒別共晶與物理混合物。通過(guò)溶解性實(shí)驗(yàn)觀察到在0.5%十二烷基硫酸鈉溶劑系統(tǒng)中，共晶溶解度較物理混合物有重要提高，這對(duì)生物利用度的提高有重要意義。

同時(shí)，大鼠初步體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，與物理混合物相比，共晶固體口服給藥在大鼠體內(nèi)的峰濃度大于物理混合物，且達(dá)峰時(shí)間明顯縮短，證明共晶能迅速發(fā)揮治療作用，具有更好的臨床應(yīng)用前景。

藥物共晶研究對(duì)于新藥的開發(fā)以及現(xiàn)有藥物的優(yōu)化都十分重要。木犀草素是一種黃酮類化合物，哌嗪是一種化學(xué)小分子，一種生物活性較強(qiáng)的物質(zhì)與一種并無(wú)明確藥效作用的物質(zhì)結(jié)合，其藥理作用是否會(huì)進(jìn)一步發(fā)生改變，還有待深入研究發(fā)掘。