周其其，閔潔，刁婷婷，3，張雨晨，肖峰，要輝，白育庭

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，咸寧 437100；2.湖北省黃石市陽新縣人民醫(yī)院護(hù)理部，黃石 435200；3.信陽農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，信陽 464000)

近年來，隨著社會(huì)的發(fā)展和生活水平的提高，人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，長(zhǎng)期的高脂飲食會(huì)誘發(fā)心腦血管、內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)病變等多種疾病。其中，高脂血癥是脂質(zhì)代謝紊亂最典型的表現(xiàn)，由高脂血癥及其誘發(fā)的其他疾病造成患者死亡人數(shù)約占世界疾病死亡人數(shù)的一半[1]。高脂血癥可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞在腎臟堆積并抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)合成，從而誘發(fā)慢性腎損傷，導(dǎo)致腎功能受損[2]，因此，由高脂血癥所誘導(dǎo)的腎臟損傷也逐漸受到關(guān)注。

山楂葉為薔薇科植物山里紅的干燥葉，其主要成分為山楂葉總黃酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)，包括槲皮素、金絲桃苷、黃酮苷、葒草素、葡荊牡黃酮等多種黃酮類化合物[3]。研究表明，HLF在心腦缺血-再灌注損傷、肝損傷、腎臟損傷等方面均有保護(hù)作用，且能降低膽固醇從而調(diào)節(jié)血脂，而對(duì)于高脂血癥所引起的腎臟損傷的研究報(bào)道較少。故本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂模型[4]，探討HLF是否對(duì)高脂血癥大鼠腎臟具有保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量170～200 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(鄂)2018-0071]；分籠飼養(yǎng)，晝夜節(jié)律12 h，自由飲水?dāng)z食，大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，室溫(22±2) ℃，相對(duì)濕度55%～60%。

1.1.2藥品與試劑 HLF購(gòu)自山東臨沂愛康藥業(yè)有限公司(批號(hào)：AKH16-3，含量93.5%)。高脂飼料購(gòu)于北京茆思倍科生物科技有限公司。三酰甘油(TG，批號(hào)：20180731)、總膽固醇(TC，批號(hào)：20180731)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批號(hào)：20180816)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批號(hào)：20180817)、超氧化物歧化酶(SOD，批號(hào)：A001-1)、丙二醛(MDA，批號(hào)：A003-1)、還原型谷胱甘肽(L-glutathione，GSH，批號(hào)：A006-1-1)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，批號(hào)：A005-1)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。兔鏈霉素卵白素-生物素法檢測(cè)(兔SP，批號(hào)：SP-9001)試劑盒購(gòu)自中山金橋公司，白細(xì)胞介素(IL)-1β(批號(hào)：EK301/3-01)、IL-6(批號(hào)：EK306/3-01)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α，批號(hào)：EK382/3-01)購(gòu)于生物聯(lián)科公司。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液(批號(hào)：DA1010)和曲拉通Triton X-100(批號(hào)：T8200)購(gòu)于索萊寶科技有限公司。單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1抗體(bs-1101R)和TGF-β1(bs-0086R)抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。核因子(nuclear factor，NF)-κB P65(#8242)購(gòu)于Cell Signaling Technology。

1.1.3儀器與設(shè)備 電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司，感量：0.1 mg)；多功能酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan Spark公司)；電腦生物組織脫水機(jī)(YAGANG公司)；石蠟包埋機(jī)(YAGANG公司)；石蠟切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂 Chemi-Doc公司)； 低溫高速離心機(jī)TGL-20M(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；KZ-II 高速組織研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與造模 SD大鼠 48只，采用隨機(jī)數(shù)字表法平均分為6組，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，辛伐他汀組，HLF小、中、大劑量組，每組8只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃0.9%氯化鈉溶液1 mL·(100 g)-1·d-1，辛伐他汀組灌胃辛伐他汀8 mg·kg-1·d-1，HLF小、中、大劑量組分別灌胃HLF 100，200，400 mg·kg-1·d-1，連續(xù)灌胃給藥8周。正常對(duì)照組每日飼喂大鼠維持普通飼料，另5組飼喂高脂飲食，飲水?dāng)z食自由。大鼠最后一次給藥禁食12 h后處死進(jìn)行取材。

1.2.2生化指標(biāo)的測(cè)定 采用酶標(biāo)儀測(cè)定血漿中的TG、TC、HDL-C和LDL-C等脂質(zhì)指標(biāo)的吸光度(A)值[5]。同時(shí)，采用同樣的方法測(cè)定血漿中的SOD、MDA、GSH和GSH-Px等氧化指標(biāo)的濃度。

1.2.3炎性指標(biāo)的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血漿中的IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.2.4蘇木精-伊紅( HE)染色法觀察大鼠腎臟組織的形態(tài) 大鼠腎臟組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)沖洗約1 h以去除表面甲醛后，電腦生物組織脫水機(jī)脫水，依次透明、浸蠟，包埋、切片、脫蠟和染色，利用顯微鏡觀察每組大鼠腎組織的病理形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5馬松(Masson)染色法觀察大鼠腎臟組織的形態(tài) 組織切片脫蠟水化與HE法相同，染色采用試劑盒說明書進(jìn)行操作，光鏡下觀察6組大鼠腎組織的纖維化程度。

1.2.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟組織中MCP-1和TGF-β1蛋白的表達(dá)情況 取各組腎臟組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，自然狀態(tài)冷卻，加入0.1%Triton X-100室溫孵育約40 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)快速洗3次(每次10 min)，封閉工作液封閉1 h，孵育一抗(1：200)過夜。PBS快速清洗3次，室溫孵育二抗1 h，PBS快速清洗3次，加入DAB染色8～10 min后用自來水沖洗數(shù)秒終止染色，蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化6 s后按照HE法進(jìn)行封片。光鏡下觀察各組的各種蛋白表達(dá)情況，利用Image profession Plus 6.0版軟件進(jìn)行分析，采用平均A值定量表示MCP-1和TGF-β1的表達(dá)量。

1.2.7Western blotting法檢測(cè)大鼠腎臟組織中NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1蛋白的表達(dá) 稱取腎臟組織約50 mg，10倍體積的裂解液(RIPA：PMSF：cocktail：礬化鈉=100：1：1：1)迅速加入，低溫下研磨組織離心后取上清液，采用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)法測(cè)定各組蛋白濃度，調(diào)整蛋白體積后加入蛋白上樣緩沖液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后一抗(1：1000)孵育14 h，與二抗反應(yīng)后顯影，利用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1HLF對(duì)高脂血癥大鼠血漿TG、TC、HDL-C、LDL-C的影響 經(jīng)前期課題組研究得出，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TG、TC以及LDL-C明顯上升(P<0.01)，說明高脂血癥模型已建立成功。與模型對(duì)照組比較，辛伐他汀組與HLF給藥組TG、TC以及LDL-C明顯降低(P<0.05)，且與劑量呈正相關(guān)[5]。

2.2HLF對(duì)高脂血癥大鼠血漿中IL-1β、IL-6以及TNF-α的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組IL-1β、IL-6以及TNF-α含量明顯增加(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，辛伐他汀組中IL-1β與TNF-α含量明顯降低(P<0.05)；HLF給藥組IL-1β、IL-6以及TNF-α均明顯降低(均P<0.05)，且與劑量相關(guān)，結(jié)果見表1。

表1 6組大鼠血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量比較Tab.1 Comparison of plasma levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α among six groups of rats pg·mL-1，±s，n=6

2.3HLF 對(duì)高脂血癥大鼠血漿中SOD、MDA、GSH以及GSH-Px的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組SOD明顯降低(P<0.05)，MDA明顯增加(P<0.05)，GSH活力與GSH-Px活力明顯降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，辛伐他汀組SOD的含量明顯增加(P<0.05)，MDA的含量明顯降低(P<0.05)，GSH-Px活力明顯增加(P<0.05)；HLF大劑量組SOD明顯增加(P<0.05)，MDA明顯降低(P<0.05)，GSH與GSH-Px活力明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 6組大鼠血漿中SOD、MDA、GSH及GSH-Px的含量比較 Tab.2 Comparison of plasma contents of SOD，MDA，GSH and GSH-Px among six groups of rats ±s，n=8

2.4HLF對(duì)高脂血癥大鼠腎臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組腎臟組織的腎小球完整，無明顯損傷；模型對(duì)照組大鼠腎臟組織中腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，體積增大，單核細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增厚，腎小球毛細(xì)血管出現(xiàn)分葉狀。與模型對(duì)照組比較，辛伐他汀組與HLF給藥組腎小球結(jié)構(gòu)有所改善，結(jié)果見圖1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。圖1 6組大鼠腎臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu) (HE，×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.1 Morphological structure of kidney tissues in six groups of rats(HE，×400)

2.5HLF對(duì)高脂血癥大鼠腎臟組織的纖維化的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組腎小球內(nèi)及腎間質(zhì)有較多的膠原纖維沉積，辛伐他汀組與HLF中、大劑量組纖維化程度明顯降低，HLF小劑量組纖維化降低程度不明顯，結(jié)果見圖2。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。圖2 6組大鼠腎臟組織的纖維化程度(Masson，×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.2 Fibrosis degree of kidney tissues in six groups of rats (Masson，×400)

2.6HLF對(duì)高脂血癥大鼠腎臟組織中MCP-1和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響(免疫組織化學(xué)檢測(cè)) 結(jié)果表明，MCP-1與TGF-β1在腎小管和集合管中呈現(xiàn)較多，腎小球中較少。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，棕色明顯加深，辛伐他汀組與HLF小劑量組顏色較模型對(duì)照組顏色稍淺，HLF中、大劑量組顏色明顯減弱，且采用Image Pro Plus 6.0版軟件定量分析后得出與觀察的結(jié)果相符合，結(jié)果見圖3～5。

A．正常對(duì)照組; B．模型對(duì)照組; C．辛伐他汀組; D．HLF 小劑量組( 100 mg·kg-1);E．HLF 中劑量組( 200 mg·kg-1) ; F．HLF 大劑量組( 400 mg·kg-1) 。圖3 6組大鼠腎臟組織中MCP-1 蛋白的表達(dá)(×400)A．normal control group; B．model control group; C．simvastatin group; D．HLF low dose group ( 100 mg·kg-1) ; E．HLF medium dose group(200 mg·kg-1) ; F．HLF high dose group ( 400 mg·kg-1) ．Fig．3 Expression of MCP-1 protein in kidney tissues of six groups of rats(×400)

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。圖4 6組大鼠腎臟組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)(×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.4 TGF-β1 protein expression in kidney tissues of six groups of rats (×400)

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。①與正常對(duì)照組比較，t=11.938，11.423，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=-9.635～-2.544，P<0.05；③與辛伐他汀組比較，t=-2.203～-2.110，P<0.05；④與HLF小劑量組比較，t=-2.518，-3.982，P<0.05。圖5 6組大鼠腎臟組織中MCP-1和TGF-β1蛋白表達(dá)的比較±s，n=5) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).① Compared with normal control group，t = 11.938，11.423，P<0.05；②Compared with model control group，t=-9.635--2.544，P<0.05；③ Compared with simvastatin group，t=-2.203--2.110，P<0.05；④Compared with HLF low dose group，t=-2.518，-3.982，P<0.05.Fig.5 Comparison of MCP-1 and TGF-β1 protein expression in kidney tissues among six groups of ±s，n=5)

2.7HLF對(duì)高脂血癥大鼠腎臟組織中NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1蛋白表達(dá)的影響(Western blotting法檢測(cè)) 模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，NF-κB P65、MCP-1與TGF-β1表達(dá)明顯增加(P<0.05)，辛伐他汀組與HLF組較模型對(duì)照組蛋白表達(dá)均有所降低，且與劑量呈相關(guān)性。結(jié)果見圖6。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。①與正常對(duì)照組比較，t=4.468～5.542，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=-5.476～-2.219，P<0.05；③與HLF小劑量組比較，t=-2.498，-2.696，P<0.05。圖6 6組大鼠腎臟組織中NF-κB P65、MCP-1及TGF-β 1蛋白表達(dá)的比較±s，n=4) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).① Compared with normal control group，t=4.468-5.542，P<0.05；② Compared with model control group，t=-5.476--2.219，P<0.05；③ Compared with HLF low dose group，t=-2.498，-2.696，P<0.05.Fig.6 Comparison of the expression of NF-κB P65，MCP-1 and TGF-β1 in kidney tissues among six groups of ±s，n=4)

3 討論

長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)一步引起腎臟結(jié)構(gòu)改變與功能損傷，包括腎小球肥大，基底膜、系膜基質(zhì)擴(kuò)張和腎臟炎癥發(fā)生，這些改變可導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[6]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組大鼠血漿中的TG、TC、LDL-C明顯增加，說明成功建立了高脂血癥模型[7]，HE染色結(jié)果顯示模型對(duì)照組大鼠腎臟組織中腎小球增大，單核細(xì)胞浸潤(rùn)，基質(zhì)增厚，腎小球出現(xiàn)肉眼可見的纖維化，說明高脂血癥能對(duì)大鼠腎臟組織造成損傷。

高脂血癥與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂時(shí)使得體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除失衡，產(chǎn)生過多的氧自由基。SOD和GSH-Px屬于酶抗氧化系統(tǒng)，其含量降低表明機(jī)體受到氧化應(yīng)激反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組血漿中SOD和GSH-Px含量明顯降低，而給予不同劑量HLF后SOD和GSH-Px含量較模型對(duì)照組增加，表明HLF具有一定的抗氧化作用。MDA屬于非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，MDA過多會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，因此可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本研究表明，模型對(duì)照組中MDA含量明顯升高，給予HLF不同劑量后MDA含量有所降低，說明HLF可能具有保護(hù)細(xì)胞的作用?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果可說明HLF保護(hù)腎損傷可能與其抗氧化有關(guān)，但具體的機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

血脂異?？纱龠M(jìn)腎臟疾病的進(jìn)展，而炎癥是高脂血癥引起腎臟疾病的重要因素之一，其病變機(jī)制可能與脂質(zhì)蓄積引起脂質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，脂質(zhì)可作為炎癥的介導(dǎo)[8]，其中IL-1β、IL-6和TNF-α是最主要的促炎因子[9]。本實(shí)驗(yàn)給予不同劑量HLF，可有效降低高脂飲食大鼠TG、TC和LDL-C，且能降低IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)，說明HLF能降低血脂且具有一定的抗炎作用。腎纖維化是由多個(gè)炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑相互作用的結(jié)果，其中關(guān)鍵的纖維化因子包括MCP-1、TGF-β1、NF-κB和TNF-α[10]。NF-κB被認(rèn)為是與炎癥相關(guān)的主要信號(hào)通路，可調(diào)控MCP-1和TGF-β1[11]。MCP-1是一種單核細(xì)胞趨化因子，高脂飲食導(dǎo)致的腎臟損傷時(shí)腎臟組織中MCP-1與TGF-β1mRNA表達(dá)增高，MCP-1及其趨化受體因子受體2(chemokine receptor 2，CCR2)因其在介導(dǎo)慢性腎臟疾病中具有重要的作用而得到了廣泛認(rèn)可[12]。TGF-β1是TGF-β的最主要亞型，在腎纖維化中是重要的炎癥/細(xì)胞驅(qū)動(dòng)因子，在許多疾病模型中，可以通過抑制TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)而減輕腎損傷和纖維化[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥大鼠腎臟組織中出現(xiàn)明顯的纖維化，且其MCP-1、TGF-β1和NF-κB的表達(dá)均有所增加，說明高脂血癥可能會(huì)促進(jìn)腎臟的纖維化。不同劑量HLF均可以降低MCP-1、TGF-β1和NF-κB的表達(dá)，減輕腎臟的纖維化，其作用機(jī)制與炎癥有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前，調(diào)血脂藥物主要以辛伐他汀為主，其用途較廣，但不良反應(yīng)較嚴(yán)重，且耐受性較差，因此，研發(fā)更安全有效的調(diào)血脂藥物具有重要的意義。HLF作為山楂葉主要活性成分之一，低毒安全，藥理作用廣泛，對(duì)糖尿病腎病和腎缺血-再灌注損傷等具有良好的保護(hù)作用[3]，其機(jī)制可能是通過調(diào)控糖尿病腎病腎組織p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而改善氧化應(yīng)激對(duì)腎組織的損傷發(fā)揮作用[14]。本研究顯示，HLF能有效降低高脂飲食大鼠的血脂，且降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，減少炎癥因子的釋放，這可能與HLF抑制NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1在腎臟中的表達(dá)有關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果相符[15]。

綜上所述，長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)導(dǎo)致大鼠的血脂升高，腎臟組織損傷，出現(xiàn)腎臟纖維化；HLF通過其抗氧化功能和炎癥調(diào)節(jié)作用以調(diào)控MCP-1與TGF-β1信號(hào)通路，從而緩解腎組織損傷，減輕腎臟的纖維化。深入研究HLF對(duì)高脂飲食人群腎臟的保護(hù)作用將為臨床防治腎臟損傷提供新的解決思路。