陳優(yōu)，肖丹，鄭生猛，胡亞軍，王小利，何尋陽*

（1. 貴州大學農學院，貴州 貴陽 550025；2. 中國科學院亞熱帶農業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；3. 中國科學院環(huán)江喀斯特生態(tài)系統(tǒng)觀測研究站，廣西 環(huán)江 547100；4. 武夷學院生態(tài)與資源工程學院 福建 武夷山 354300）

自上世紀90年代實施“退耕還林”等生態(tài)恢復工程以來，我國西南喀斯特地區(qū)植被恢復取得較好成效，石漠化趨勢得以初步遏制[1-2]。人工造林在喀斯特地區(qū)大面積復綠中發(fā)揮了重要作用，也為我國實施“固碳減排”的行動做出了貢獻[3]。但另一方面，單一人工林也存在弊端，常會導致土壤質量下降。目前人工林經營面臨著如何維持造林效益、保障其可持續(xù)性等困難。而充分發(fā)掘土壤有益微生物資源，將其用于改善人工林土壤質量，可能是破題的關鍵。

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在陸地生態(tài)系統(tǒng)中分布廣泛，能夠與80%以上的高等植物形成互惠共生體[4]。AMF具有廣泛的生態(tài)功能，如促進植物對養(yǎng)分（特別是磷）的獲取[5]、土壤團粒的形成和土壤水分的保持[6-7]等。土壤AMF在促進退化土壤生態(tài)恢復中具有重要的應用潛力[8]，已被廣泛應用于荒漠、鹽堿地、礦山等生態(tài)系統(tǒng)修復中[9]。大量的科學證據(jù)表明，AMF可以顯著改善土壤性質，增加地上和地下生物多樣性，提高喬、灌木幼苗在水分和養(yǎng)分脅迫下的生存、生長和種群構建能力[9]。干旱脅迫下，接種叢枝菌根真菌能夠有效促進喀斯特鄉(xiāng)土樹種（任豆）幼苗根、莖生長，提高植株的抗旱能力[10]。另一盆栽試驗證實，AMF能顯著促進喀斯特地區(qū)造林樹種（青岡櫟）地上部生長，提高植株對土壤水分和礦質元素吸收[11]。就AMF接種效果而言，本地真菌要優(yōu)于外來真菌，組合菌群比少數(shù)種或單一種更好[9]。因此，未來將AMF應用于改善人工林土壤、提升造林效益具有可觀的應用前景。而了解土壤AMF群落對不同巖性條件下土壤造林的響應則是將其合理利用于可持續(xù)人工林經營管理的重要前提。

我國西南喀斯特地區(qū)具有獨特的地形地質背景，其巖溶作用強烈，土層淺薄且不連續(xù)，土壤由不同母巖發(fā)育而成[12-14]。成土母巖決定了發(fā)育土壤的物理化學性質（如土壤質地、pH）的差異[15]，進而會影響到土壤AMF群落特征[16-17]。人工造林主要是改變了土壤AMF生存所需的水分、養(yǎng)分等微生境，也會對AMF群落多樣性產生影響[18]。但喀斯特地區(qū)巖性和人工造林對土壤AMF群落影響的相對重要性，以及兩者是否存在交互作用目前尚不明確。本研究以我國西南喀斯特兩種典型母巖（石灰?guī)r和碎屑巖）人工林土壤為研究對象，探討不同巖性條件下人工造林對AMF群落的影響。為合理利用土壤AMF用于退化地區(qū)的人工造林生態(tài)恢復模式提供理論基礎。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于廣西壯族自治區(qū)河池市都安縣（23°47′～24°35′N，107°51′～108°30′E）。該區(qū)屬亞熱帶季風性氣候，年平均氣溫為19.6～21.6 ℃，1月最低（12.2 ℃），7月最高（28.6 ℃）。年平均降水量為1 726 mm，具有明顯的季節(jié)模式，其中4～9月是雨季。地勢西北高、東南低，地貌景觀奇特，是全國巖溶地貌發(fā)育最為典型的地區(qū)之一。成土母巖主要為石灰?guī)r，根據(jù)聯(lián)合國糧農組織/聯(lián)合國教科文組織的分類體系，石灰?guī)r之上為鈣質巖石土（石灰?guī)r土），碎屑巖之上為鐵鋁土（紅壤）。

2 研究方法與數(shù)據(jù)分析

2.1 樣地遴選和樣品采集

在本研究中，取樣區(qū)域主要成土母巖為石灰?guī)r和碎屑巖。研究區(qū)域由于巖性不同，其適生樹種也存在差異，人工林種植樹種多樣，并不統(tǒng)一，因此本研究僅考慮人工造林而非種植樹種的影響。采用空間序列代替時間序列的方法，石灰?guī)r區(qū)選取種植15 a的任豆（Zenia insignis）、香椿（Toona sinensis）和板栗（Chestnut）人工林為研究對象；碎屑巖區(qū)選取與石灰?guī)r區(qū)同樣種植年齡的松樹（Pinus）和杉樹（Fir）人工林為研究對象，耕地（玉米地）作為參考。土壤采樣時間為2015年3月底至6月初。在每個采樣點選取20 m×30 m區(qū)域，每個小區(qū)隨機采集10～15個土芯（深0～15 cm，直徑5 cm），混合成一個復合樣品。經四分法取約150 g，用錫箔紙包住，放入滅菌袋，投入液氮罐中冷凍，立即送回實驗室，置于-70 ℃冰箱備用。剩余土樣裝入袋中，帶回實驗室用2 mm網篩篩去根、石屑等，風干，用于常規(guī)理化指標測定。

2.2 土壤理化性質測定

土壤理化性質測定參考鮑士旦[19]的方法，用pH計測定土壤pH值（土水比1∶2.5）；采用重鉻酸鉀氧化法測定土壤有機碳（soil organic carbon，SOC）；氮元素分析儀（EA3000；EuroVector，意大利）測定土壤全氮（total nitrogen，TN）；采用H2SO4+HClO4溶液酸消化法測定土壤全磷(total phosphorus，TP)；采用火焰光度法測定土壤全鉀(total potassium，TK)；采用鉬銻抗比色法(Olsen法)測定速效磷(available phosphorus，AP)；采用激光粒度儀Mastersizer 2000 (Malvern Instruments, Malvern, England)測定土壤機械組成；在pH 7.0條件下，用1 mol/L乙酸銨置換可交換性鈣和鎂，并采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜 (ICP-AES)對其進行分析。

2.3 DNA提取和PCR擴增

從-70 ℃冰箱中取出經冷凍干燥后的土壤樣品0.5 g，使用土壤DNA快速提取專用試劑盒（Fast DNA?SPIN Kit for Soil, MP）提取土壤總DNA（具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行）。用核酸檢測儀和12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分別檢測DNA濃度及質量，并記錄每個樣品的DNA濃度及A260/A280、A260/A230信息。確定樣品質量完全符合后續(xù)試驗要求后，將樣品進行分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 高通量測序

本文選用巢式PCR，第1對擴增引物為AML1/AML2（5'-3'序列，AML1：ATCAACTTTCGATGGT AGGATAGA；AML2：GAACCCAAACACTTTG GTTTCC），目的片段長度在500 bp左右；第2對擴增引物是AMV4.5NF/AMDGR（5'-3'序列，AMV4.5 NF：AAGCTCGTAGTTGAATTTCG；AMDGR：CCCAACTATCCCTATTAATCAT），目的基因片段長度約250 bp。所需引物均由上海英濰捷基貿易有限公司合成。巢式PCR第1步的擴增體系為20 μL，其中DNA模板1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，2×PCR Ex Taq（TaKaRa，Japan）10 μL，ddH2O補 至20 μL。擴增程序：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃30 s、退火58 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；保溫4 ℃。第2步擴增體系為20 μL，其中模板（將第1步PCR產物稀釋50倍）1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，2×PCR Ex Taq（TaKaRa，Japan）10 μL，ddH2O補至20 μL。擴增程序：預變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 45 s、退火60 ℃ 45 s 、延伸72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；保溫4 ℃。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到的PCR產物按測序公司的送樣包裝要求（放入2 ml滅菌離心管中，并在離心管上標記對應樣品編號）保存[20]，送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序。

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0和Microsoft Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)在分析之前進行了正態(tài)性檢驗。采用獨立樣本T檢驗比較土壤理化變量、AMF群落多樣性以及屬水平上的相對豐度在石灰?guī)r與碎屑巖、人工林與耕地間的差異。巖性與人工造林間的交互作用采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）進行。運用R軟件進行AMF香農多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)計算。采用Canoco 5進行冗余分析（RDA），探討土壤理化性質對AMF屬水平上的相對豐度、多樣性以及群落特征的影響。采用Amos軟件構建結構方程模型，分析巖性、人工造林、環(huán)境因子對AMF群落特征的作用機制。其中AMF群落特征由所有OTU進行NMDS分析，用降維后結果的第一軸表征。采用Origin 2018作圖。

3 結果與分析

3.1 石灰?guī)r和碎屑巖土壤理化性質變化特征

由表1可以看出，在石灰?guī)r土壤中，人工造林顯著降低了土壤有機碳、全磷和速效磷含量；碎屑巖土壤中，人工造林增加了土壤全鉀含量，降低了土壤交換性鈣、交換性鎂、速效磷和黏粒含量（p<0.05）。同一利用方式下，全磷、交換性鈣含量和pH值在石灰?guī)r土壤中均顯著高于碎屑巖。耕地土壤有機碳和砂粒含量在石灰?guī)r較高，而石灰?guī)r全鉀和黏粒含量卻顯著低于碎屑巖。在人工造林條件下，石灰?guī)r土壤全氮和交換性鎂的含量顯著高于碎屑巖土壤（p< 0.05），而有機碳和土壤質地在二者之間的差異因人工造林這一措施而減弱。根據(jù)全國土壤養(yǎng)分分級標準，喀斯特地區(qū)耕地土壤速效磷含量處于中上水平（10 ～ 20 mg/kg），人工造林使土壤速效磷含量降至低（3 ～ 5 mg/kg）或極低（< 3 mg/kg）水平，表明在喀斯特地區(qū)退耕地進行人工造林均顯著降低土壤速效養(yǎng)分磷含量。

表1 石灰?guī)r和碎屑巖地區(qū)土壤理化特征Table 1 Soil physicochemical properties of limestone and clasolite region

3.2 土壤叢枝菌根真菌群落組成

如圖1所示，石灰?guī)r和碎屑巖土壤中AMF群落在屬水平上可鑒定為7個主要的共有屬，包括球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）、無梗囊霉屬（Acaulospora）、類球囊霉屬（Paraglomus）、多樣孢囊霉屬（Diversispora）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）以及原囊霉屬（Archaeospora）。球囊霉屬占所有土壤樣品的58.50%～89.37%，是調查區(qū)優(yōu)勢屬，近明球囊霉屬次之。其他屬包括巨孢囊霉屬（Gigaspora）、兩性囊霉屬（Ambispora）、雷德克囊霉屬（Redeckera）及內養(yǎng)囊霉屬（Entrophospora）。其中，巨孢囊霉屬僅在石灰?guī)r耕地（0.02%）和碎屑巖人工林（0.01%）中被發(fā)現(xiàn)；兩性囊霉屬和雷德克囊霉屬分別在石灰?guī)r和碎屑巖人工林土壤中未被發(fā)現(xiàn)；內養(yǎng)囊霉屬僅存在于碎屑巖耕地土壤中（0.01%）。

圖1 石灰?guī)r和碎屑巖區(qū)土壤AMF群落在屬水平結構的相對豐度Fig. 1 Relative abundance of arbuscular mycorrhizal fungal community in soils under limeston and clasolite region at genus level

在石灰?guī)r區(qū)進行人工造林并未顯著改變土壤AMF群落組成；在碎屑巖區(qū)進行人工造林顯著增加了球囊霉屬相對豐度，卻顯著降低了近明球囊霉屬和類球囊霉屬的相對豐度。表明喀斯特地區(qū)土壤AMF球囊霉屬的生態(tài)適應性極強，在碎屑巖區(qū)進行人工造林更加有利于其生長和繁殖，非優(yōu)勢屬的生長則受到不同程度的抑制作用。同一利用方式不同巖性間比較，石灰?guī)r區(qū)耕地土壤無梗囊霉屬相對豐度顯著低于碎屑巖耕地；人工造林條件下，石灰?guī)r區(qū)土壤近明球囊霉屬的相對豐度顯著高于碎屑巖（表2）。說明石灰?guī)r和碎屑巖區(qū)土壤AMF群落組成存在的差異在進行人工造林后有所變化。

表2 石灰?guī)r和碎屑巖區(qū)土壤AMF群落屬水平的差異Table 2 AMF community compositions at the genus level between limestone and clasolite region

3.3 土壤叢枝菌根真菌多樣性

去除嵌合體和與AMF不匹配的序列后，所有土壤樣品共得到42 888條優(yōu)質序列。將這些序列聚類為OTUs（相似度為97%），其數(shù)量表示AMF的物種豐富度。AMF物種豐富度的平均數(shù)在石灰?guī)r耕地與人工林分別為96和105，碎屑巖耕地與人工林分別為98和96，不同類型土壤間無顯著性差異。同一利用方式下，石灰?guī)r區(qū)人工林土壤AMF香農多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均顯著高于碎屑巖區(qū)人工林（圖2a、2b）。石灰?guī)r區(qū)進行人工造林后使土壤AMF多樣性有增加的趨勢，其中香農多樣性指數(shù)達到顯著水平。表明石灰?guī)r區(qū)進行人工造林能夠提高土壤AMF多樣性，使AMF群落更加穩(wěn)定；碎屑巖區(qū)進行人工造林并沒有改變土壤AMF多樣性，進一步說明了石灰?guī)r區(qū)土壤AMF多樣性對生態(tài)恢復的響應更敏感。

圖2 土壤AMF香農多樣性指數(shù) (a) 和均勻度指數(shù) (b)Fig. 2 Shannon diversity index (a) and Evenness index (b) of arbuscular mycorrhizal fungal

3.4 土壤叢枝菌根真菌群落的影響因素

雙因素方差分析結果（表3）顯示，巖性顯著影響AMF多樣性（p< 0.01）和多樣孢囊霉屬的相對豐度（p< 0.05）。人工造林對球囊霉屬和近明球囊霉屬相對豐度影響顯著（p< 0.01）。兩者對AMF多樣性無交互作用，但對球囊霉屬、近明球囊霉屬、類球囊霉的相對豐度存在顯著的交互作用（p< 0.05）。

表3 巖性和人工造林對AMF多樣性及群落的雙因素方差分析Table 3 Effect of lithology and afforestation on arbuscular mycorrhizal fungi diversity and community by two-way ANOVA

RDA分析表明（圖3a），第1、第2排序軸能夠在累計解釋石灰?guī)r與碎屑巖土壤AMF群落在屬水平結構相對豐度變異的47.1%，交換性鈣（F=3.0，p=0.009）和交換性鎂（F=2.2，p=0.035）是主要的影響因子。球囊霉屬的相對豐度與土壤有機碳、全磷、全鉀以及砂粒含量呈正相關且相關性較弱，與速效磷和黏粒含量呈負相關；近明球囊霉屬則與之相反。多樣孢囊霉屬與pH、全氮、全磷、有機碳及交換性鈣含量呈正相關，與速效磷、黏粒及全鉀含量呈負相關關系；類球囊霉屬與交換性鈣、交換性鎂呈正相關，與全鉀呈負相關。環(huán)境因子分別能夠解釋土壤AMF多樣性和群落特征71.48%和27.42%的變異，其中土壤pH和速效磷含量是影響AMF群落特征的關鍵因子（圖3b、3c）。

圖3 土壤理化性質對AMF優(yōu)勢屬的相對豐度(a)、多樣性(b)以及群落特征 (c) 的影響Fig. 3 The influence of soil physicochemical properties on the relative abundance of dominant genus (a), diversity (b) and community characteristic (c) of arbuscular mycorrhizal fungal

結構方程模型（SEM）分析得到一個比較好的擬合關系（χ2=1.82, df=4,P=0.77, RMSEA=0.000,GFI=0.96），能夠解釋AMF群落88%的變異（圖4）。從模型的路徑系數(shù)可以看出，巖性通過影響pH、人工造林通過改變速效磷含量分別作用于AMF群落（圖4），進一步突顯了土壤pH和速效磷含量對AMF群落特征的重要性。

圖4 基于影響AMF群落特征的關鍵因子構建結構方程模型Fig. 4 Structural equation model of key factors affecting arbuscular mycorrhizal fungal community characteristic

4 討論

4.1 巖性對土壤叢枝菌根真菌群落的影響

巖性作為陸地表面的關鍵組成部分，是影響土壤性狀的主導因素。由不同母巖發(fā)育的土壤，其理化性質如pH、有機碳、全磷、全鉀、交換性鈣含量及其機械組成等會表現(xiàn)出不同程度的差異，進而可能引起土壤AMF群落的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，人工林土壤AMF群落香農多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)在石灰?guī)r高于碎屑巖（圖2），這可能與兩種巖性間土壤pH和氮、磷等養(yǎng)分存在差異有關。不論是耕地還是人工林，石灰?guī)r土壤pH均顯著高于碎屑巖土壤（表1），而土壤pH對微生物群落的作用已在諸多的研究中得到證實[21-22]。土壤pH會影響菌絲生長、孢子萌發(fā)，改變菌根侵染率，導致AMF的分布受到影響[21]。邱江梅等[22]研究表明，土壤pH與AMF香農多樣性指數(shù)呈顯著正相關關系。最近研究表明，巖性還可以通過影響地上植物養(yǎng)分資源獲取策略，作用于菌根-植物共生體，進而影響到AMF群落特征[23]。梁月明等[24]研究結果也表明，巖性主要是通過影響植物與土壤養(yǎng)分來影響土壤AMF群落組成結構及豐度。

本研究中，巖性對AMF的群落組成作用并不突出，除了無梗囊霉屬外，AMF其他優(yōu)勢屬在不同巖性間無顯著差異。球囊霉屬是研究區(qū)兩種巖性中的絕對優(yōu)勢屬，占所有土壤樣品的58.50%～89.37%。大量研究認為，球囊霉屬生態(tài)適應性極強，是諸多生態(tài)系統(tǒng)的優(yōu)勢屬[25-28]，能夠支持本研究結果。球囊霉屬能廣泛分布于不同pH的土壤中，尤喜在堿性和中性土壤中生長[29]。魏源等[30]對喀斯特地區(qū)叢枝菌根真菌遺傳多樣性的研究表明球囊霉屬極有可能是喀斯特地區(qū)AMF的優(yōu)勢菌屬。Likar等[31]研究喀斯特土壤中的AMF多樣性及其分布，同樣發(fā)現(xiàn)球囊霉屬是喀斯特生境中穩(wěn)定存在的優(yōu)勢屬。而無梗囊霉屬在石灰?guī)r耕地土壤中顯著低于碎屑巖耕地，這可能與巖性所導致的土壤pH差異有關。張美慶等[32]對我國北方泡囊叢枝狀（VA）菌根真菌的生態(tài)分布研究結果表明無梗囊霉屬多存在于酸性土壤。綜合說明喀斯特地區(qū)不同巖性對土壤叢枝菌根真菌群落的影響主要通過pH來調控。

4.2 人工造林對土壤叢枝菌根真菌群落的影響

人工造林會改變土壤理化性質如速效磷、全鉀及黏粒含量，進而會間接影響AMF群落組成結構和多樣性。本研究中，在碎屑巖區(qū)進行人工造林顯著增加了球囊霉屬相對豐度、降低了近明球囊霉屬和類球囊霉屬的相對豐度（表2），而石灰?guī)r區(qū)土壤中AMF群落組成并未受到人工造林的顯著影響；說明碎屑巖區(qū)土壤AMF群落結構對人工造林的響應更敏感。不同屬對人工造林的響應表現(xiàn)出差異，可能與它們各自的生境偏好有關。碎屑巖人工造林顯著增加了球囊霉屬相對豐度，可能與球囊霉屬具有極強的環(huán)境適應能力且有著獨特的繁殖特性有關[33-34]；造林降低土壤黏粒含量，改善了土壤通氣性，更有利于球囊霉屬而非近明球囊霉屬的生長[35]。造林導致近明球囊霉屬相對豐度降低可能是近明球囊霉屬對速效磷的需求較高（本研究中近明球囊霉屬與速效磷呈正相關關系），而人工造林顯著降低了速效磷含量，故而導致其相對豐度下降。因此，在碎屑巖區(qū)進行人工造林能夠使得球囊霉屬的優(yōu)勢地位更為突出，而部分非優(yōu)勢屬卻受到抑制。

值得注意的是，在石灰?guī)r和碎屑巖地區(qū)進行人工造林恢復生態(tài)系統(tǒng)的措施，會使AMF的一些非優(yōu)勢屬消失：石灰?guī)r造林導致巨孢囊霉屬和兩性囊霉屬消失，碎屑巖造林導致雷德克囊霉屬和內養(yǎng)囊霉屬消失。此外，在碎屑巖地區(qū)進行人工造林有助于巨孢囊霉屬的出現(xiàn)，說明喀斯特地區(qū)進行人工造林將會改變土壤AMF群落組成，對于不同巖性土壤其群落組成的變化有所差異。

石灰?guī)r地區(qū)進行人工造林顯著增加土壤AMF香農多樣性指數(shù)，可能與人工造林降低了土壤有機碳、全磷及速效磷含量有關。研究表明，土壤有機碳含量較高時，AMF的伴生微生物有可能因獲得更多營養(yǎng)而大量繁殖，進而抑制AMF對根系的浸染[36]。土壤中速效磷含量與AMF多樣性呈負相關關系[37-39]，可能是由于植物在低磷土壤中高度依賴AMF獲取磷所導致[40]。另外，本研究中兩種巖性條件下耕地進行人工造林之后土壤速效磷含量均處于較低水平[41]，缺磷的環(huán)境可能會刺激AMF的生長和代謝。而在碎屑巖地區(qū)進行人工造林并未顯著改變土壤AMF多樣性指數(shù)。因此，在喀斯特地區(qū)進行人工造林生態(tài)恢復措施會改變土壤養(yǎng)分（特別是速效磷）從而間接影響AMF群落結構和多樣性，但其影響受制于巖性。綜上，本研究認為，在喀斯特地區(qū)進行人工造林對土壤AMF群落的影響依賴于巖性的調控，土壤pH和速效磷是決定AMF群落的關鍵因子。

5 結論

1）巖性顯著影響喀斯特土壤AMF群落多樣性，人工造林則主要影響群落結構，兩者對優(yōu)勢屬的相對豐度存在交互作用。土壤AMF群落結構對人工造林的響應在石灰?guī)r區(qū)比碎屑巖區(qū)更敏感。

2）土壤pH和速效磷含量是影響喀斯特土壤AMF群落的關鍵環(huán)境因子，前者由巖性自身差異引起，后者因人工造林而發(fā)生改變。

3）利用土壤AMF促進西南喀斯特地區(qū)人工林的生態(tài)恢復時要充分考慮巖性背景的制約與土壤磷素的科學管理。