高俊峰，陳夢瑩，邵 瑞，黃 婷

(國糧武漢科學研究設計院有限公司//國家飼料質量檢驗檢測中心(武漢)，湖北 武漢 430079)

氯霉素是一種常見的廣譜抗生素藥物,曾廣泛用于飼料和養(yǎng)殖行業(yè)[1]。有研究證明，氯霉素能通過食物鏈對人畜健康造成明顯危害[2]。隨著農業(yè)部194號、250號公告的發(fā)布，規(guī)定氯霉素類藥物不得在飼料和動物源性食品中使用和檢出[3-4]，因此對氯霉素的準確檢測很有必要。我們采用液質聯(lián)用內標法測定飼料中氯霉素殘留量，依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》對方法的不確定度進行分析評估[5]，以期在實驗過程中控制和避免影響氯霉素含量測定的關鍵因素，從而提高檢測結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色譜質譜聯(lián)用儀,美國賽默飛世爾公司；IKA VORTEX2渦旋混合儀,德國IKA公司；SIGMA 3K15高速冷凍離心機,德國Sigma公司；ASE-12固相萃取儀,天津奧特賽思儀器有限公司；ME104電子天平,瑞士特勒托利多公司；12位氮吹儀,上海安譜實驗科技股份有限公司；0.22 μm有機濾膜，天津津騰實驗設備有限公司。

氯霉素、氯霉素-D5標準品,北京壇墨質檢標準物質中心；乙酸乙酯、甲醇、乙腈、正己烷(色譜純)，美國BCR試劑公司；甲酸、氨水(色譜純)，天津科密歐化學試劑公司；飼料樣品(氯霉素陰性),國家飼料質量檢驗檢測中心(武漢)；C18固相萃取柱,上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1標準系列溶液配制

氯霉素-D5內標工作液(100 ng/ml)：使用移液器移取100.0 μg/ml氯霉素-D5內標標準溶液(溶劑為甲醇)10 μl于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線。

氯霉素標準工作液(100 ng/ml)：使用移液器移取100.0 μg/ml氯霉素標準溶液(溶劑為甲醇)10 μl于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線。

標準曲線的制備: 使用移液器移取氯霉素標準工作液和氯霉素-D5內標工作液適量于1 ml容量瓶中，用一級水配置成氯霉素質量濃度分別為1.0、3.0、5.0、10.0和20.0 ng/ml，氯霉素-D5質量濃度為10.0 ng/ml的混標上機液。

1.2.2樣品的前處理

參考農業(yè)部2483號公告-8-2016中的檢測方法[6]。平行稱取五份1.1中的飼料樣品，每份2 g(準確至0.000 1 g)，置于50 ml具蓋離心管中，分別加入100 μl 配制的氯霉素-D5內標工作液、氯霉素標準工作液，再加入0.3 ml氨水、10 ml乙酸乙酯，渦旋2 min后振蕩提取10 min，6 000 r/min離心10 min后提取上清液轉入氮吹管中，重復上述操作1次，合并2次上清液，45℃水浴氮氣吹干。向吹干后的殘渣中加入5%甲醇4 ml復溶，再加入4 ml經(jīng)甲醇-水飽和過的正己烷除脂2次。取用3 ml甲醇、3 ml水活化過的C18萃取柱，上樣后用3 ml水淋洗，3 ml甲醇洗脫，收集洗脫液于45℃氮氣吹干。用單標線移液管移取1 ml一級水復溶，過0.22 μm有機濾膜后上機待測。

1.3 不確定度評定的數(shù)學模型

測定飼料中氯霉素含量的數(shù)學模型為：

式中，X為飼料樣品中氯霉素殘留量，μg/kg；C為從標準曲線中讀出的飼料中氯霉素上機液測定質量濃度，μg/L；V為上機液最終定容體積，ml；m為飼料樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 不確定度分量的評估

2.1.1標準系列溶液操作引入的不確定度

2.1.1.1標準溶液純度引入的不確定度

查詢標準溶液證書，氯霉素標準溶液、氯霉素-D5內標溶液不確定度為3%，k=2，按均勻分布計算，則2種標液的相對不確定度為：

2.1.1.2標準溶液和內標溶液配制引入的不確定度

(1)容量瓶引入的不確定度

依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃器皿檢定規(guī)程》[7]，20℃下，1 ml和10 ml的容量瓶引入的不確定度計算見表1。

表1 容量瓶引入的不確定度

根據(jù)表1可得容量瓶引入的不確定度：

=0.026 517

(2)移液器引入的不確定度

依據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[8]，同時參考移液器檢定證書，將移液器移取3次10 μl甲醇引入的不確定度計算如下：

同理可得出1.2.1標準系列溶液配制過程中移液器移取不同體積、不同次數(shù)的標準溶液引入的不確定度，計算如表2。

表2 10～100 μl移液器引入的不確定度

綜上，移液器引入的相對標準不確定度：

2.1.2樣品前處理引入的不確定度

2.1.2.1稱樣量引入的不確定度

2.1.2.2添加標準工作液和內標液引入的不確定度

據(jù)1.2.2可知，使用10～100 μl移液器分別向5份氯霉素陰性飼料樣品中添加了氯霉素標準工作液和氯霉素-D5內標液100 μl，參照表2內容，可得添加標準工作液和內標液引入的相對不確定度：

2.1.2.3配制上機液引入的不確定度

由1.2.2可知，配制上機液使用1 ml單標線移液管5次。依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃器皿檢定規(guī)程》[7]，并查詢檢定證書，其不確定度計算過程匯總如表3。

表3 1 ml單標線移液管引入的不確定度

根據(jù)表3可得1 ml單標線移液管引入的相對標準不確定度：

=0.001 629

2.1.3重復測定引入的不確定度

依據(jù)CNAS-GL006—2019《化學分析中不確定度的評估指南》[9]，重復測定引入的不確定度按A類評估，測定的結果見表4。由表4可得標準偏差：

重復測定5次氯霉素平均值的標準不確定度：

樣品重復測定引入的相對不確定度：

2.1.4標準曲線擬合引入的不確定度

以氯霉素標準溶液質量濃度值為X軸，氯霉素標液與氯霉素-D5內標物質譜峰面積比值為Y軸，繪制標準曲線，對5個不同質量濃度的標準系列溶液進行擬合測定，其結果如表5所示。

根據(jù)表5可得氯霉素標準曲線的擬合標準差為：

表5 氯霉素標準曲線方程及計算結果

=0.011 860

式中，t為標準溶液測定次數(shù)(t=5)；Yp代表氯霉素標準工作液與氯霉素-D5內標工作液實測質譜峰面積比值；Y代表Ci通過曲線方程計算出的結果。由此可得標準曲線擬合引入的標準不確定度：

=0.079 631

表4 飼料中氯霉素的重復測定結果

綜上，可得標準曲線擬合引入的相對不確定度：

2.2 合成不確定度

由2.1中各分量不確定度的評估結果，得出合成相對標準不確定度為：

=(0.0152+0.0152+0.026 5172+0.046 2092+0.000 0992+0.078 4852+0.001 6292+

飼料中氯霉素含量平均值為5.006 μg/kg ，則合成標準不確定度為：

=0.488 μg/kg

2.3 測量不確定度報告

綜合2.1和2.2所述，依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[5]，在95%置信概率下取包含因子k=2，測量結果的擴展不確定度為：U=2×u(X)=2×0.488=0.976 μg/kg。因此，采用液質聯(lián)用內標法測定飼料中氯霉素殘留量的結果表示為：X=(5.01±0.98)μg/kg(k=2)。

3 結論

我們采用液質聯(lián)用內標法測定飼料中氯霉素的殘留量，從標準系列溶液操作、樣品前處理、樣品重復測定、標準曲線擬合四個方面考慮不確定度的引入及評定，從最終測量不確定度的報告結果看，可以考慮通過選用更高純度標準品和更高精密度的器具，優(yōu)化前處理步驟，提高重復測定次數(shù)等方面來降低試驗結果的不確定度，從而提高實驗室測定飼料中氯霉素殘留量的準確度。