伍牧鋒　梁曉　陳青　伍春玲　劉迎　劉小強　韓志玲

摘? 要：為初步探究生氰糖苷降解途徑2個基因和在木薯品種對二斑葉螨抗性中的作用，本研究以抗螨木薯品種‘C1115’‘緬甸’‘SC9’和感螨木薯品種‘SC205’‘面包’‘BRA900’為材料，分析木薯生氰糖苷降解途徑基因及其編碼的生化酶在二斑葉螨取食木薯品種不同部位葉片（上部、中部和下部）不同時間后（1、4?d）的表達量及酶活性的變化情況。結(jié)果表明，在感螨木薯品種上部和中部葉片中的表達量隨螨害時間的延長而顯著降低;在抗螨木薯品種的不同部位葉片中，的表達量均隨螨害時間的延長而顯著升高，并且以中部和下部葉片的升高趨勢更為顯著。在抗、感螨木薯品種不同部位葉片中的表達量均很低，難以比較該基因的表達量在不同木薯品種、不同部位葉片受螨害后的變化情況，但在能檢測到的少量樣品當中，抗螨木薯品種的占比也多于感螨木薯品種。進一步進行酶活性分析結(jié)果表明，抗螨木薯品種受螨害后，隨著時間的延長，降解途徑基因編碼的α-HNL酶活性呈逐漸升高或維持不變的趨勢，并且以中部和下部葉片的升高趨勢更為顯著，而在感螨木薯品種中，隨著螨害時間的延長，α-HNL酶活性則呈逐漸降低或先升高后降低的趨勢;基因編碼的β-GLU酶活性在不同木薯品種中均呈較低的水平，這可能與其對應編碼的基因表達量低有關，但總體而言，降解途徑2個基因編碼的降解酶α-HNL和β-GLU在抗螨木薯不同葉片組織中的活性總體上也顯著高于感螨木薯。本研究初步揭示了不同木薯品種受螨害不同時間后，生氰糖苷降解基因和酶可能與木薯對二斑葉螨的抗性有關。

關鍵詞：生氰糖苷;二斑葉螨;抗、感木薯品種;降解途徑;基因表達中圖分類號：S435.33 ?????文獻標識碼：A

Resistance Mechanism of Cassava Cultivars to Based on Gene Expression Characteristics of Cyanogenic Glycoside Degradation Pathway

WU MufengLIANG XiaoCHEN QingWU ChunlingLIU YingLIU Xiaoqiang?HAN Zhiling

1. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， China Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Engineering Research Center for Biological Control of Tropical Crops Diseases and Insect Pests， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Sanya， Hainan 572000， China

In order to explore the resistance mechanism of cassava varieties based on the gene expression characteristics of cyanogen glycoside degradation pathway to ， this study used mite-resistant cassava cultivars ‘C1115’ ‘Myanmar’ ‘SC9’ and mite-susceptible cassava cultivars ‘SC205’ ‘Mianbao’ ‘BRA900’ as materials to analyze the cyanogen glycoside degradation pathway genes related to plant insect resistance and the biochemical enzymes changes in the leaves of different parts （top， middle and bottom） when those mites fed for 1 d and 4 d， respectively. The results showed that the expression of in the top and middle leaves of mite-susceptible cassava varieties decreased significantly with the extension of the mite infestation time. In the leaves of different parts of mite-resistant cassava varieties， the expression level of increased significantly with the extension of the mite infestation time， and the increasing trend was more significant in the middle and bottom leaves. The expression of in the leaves of different parts of the mite-resistant cassava varieties was very low. It is difficult to compare the changes in the expression level of this gene after different cassava varieties and different parts of the leaves are damaged by mites， but it is not detectable. Among a small number of samples， the proportion of mite-resistant cassava varieties was more than that of mite-susceptible cassava varieties. The results of further enzyme activity analysis showed that after the mite-resistant cassava varieties were infested by mites， as time passed， the enzyme activity of α-HNL encoded by the degradation pathway gene showed a tendency to gradually increase or remain unchanged， and the rising trend of the middle and bottom blades was more significant. In the mite-susceptible cassava varieties， with the extension of the mite infestation time， the enzyme activity of α-HNL showed a trend of gradual decrease or first increase and then decrease. The β-GLU enzyme activity encoded by the gene showed low levels in different cassava varieties， which may be related to the low expression of the corresponding encoded gene. But overall， the degrading enzymes α-HNL and β-GLU encoded by the two genes of the degradation pathway in different leaf tissues of mite-resistant cassava were also significantly higher than that of mite-susceptible cassava. This study initially revealed that cyanogenic glycoside degradation genes and enzymes may be related to the resistance of cassava to Tetranychus urticae after different cassava varieties were infested by mites for different periods of time.

cyanogenic glycoside;; mite-resistant and mite-susceptible cassava cultivars; degradation pathway; gene expression

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.021

木薯（Crantz）是重要的糧食作物和工業(yè)原料，是僅次于水稻、玉米、甘蔗、甘薯的第五大作物，也是我國重要的救荒作物和能源作物。二斑葉螨（ Koch）是重要的世界危險性害螨，寄主十分廣泛，目前已成為為害木薯最嚴重的有害生物之一，不易藥劑防治。培育和利用抗蟲品種是國內(nèi)外公認的防治二斑葉螨最有效、簡便和經(jīng)濟的防治措施。

植物中具有抗蟲功能的次生代謝物質(zhì)的創(chuàng)新利用是培育抗蟲品種的有效途徑。次生代謝物質(zhì)可以抑制害蟲取食，降低害蟲產(chǎn)卵率，還可以引誘天敵，在植物抵御害蟲為害時發(fā)揮重要作用。生氰糖苷作為重要次生代謝物質(zhì)，廣泛存在于大約12 000種植物之中，如木薯、高粱、利馬豆、杏仁等。在植物組織中，生氰糖苷本身并不具有毒性，但當生氰植物組織被破壞，存在于不同組織的生氰糖苷和降解酶彼此接觸發(fā)生水解反應，才能釋放出有毒的氫氰酸。生氰糖苷的降解由和基因控制（圖1），分別編碼β-葡萄糖苷酶和羥基腈裂解酶。研究表明，生氰糖苷及其降解途徑基因和在植物防御蟲害方面發(fā)揮重要作用，其抗蟲功能已在利馬豆對草地貪夜蛾、水稻對稻飛虱和花生對蚜蟲的防御研究以及生氰糖苷與害蟲相互作用的研究中有所體現(xiàn)。

木薯是典型的生氰作物，其生氰糖苷以亞麻苦苷和百脈根苷2種形式存在，分別占體內(nèi)總量的95%～97%和3%～5%。生氰糖苷能否發(fā)揮抗蟲功能，除了含量高低以外，還取決于其降解釋放出有毒的氫氰酸的能力大小，而和基因的表達水平反映了這種能力，且與作物對害蟲的抗性水平密切相關。然而，當前尚無研究表明不同木薯品種對二斑葉螨的抗性差異與其為害后木薯葉片中生氰糖苷降解途徑基因的表達特性差異有關。鑒于此，本研究擬分析二斑葉螨取食不同抗性水平的木薯品種后，不同葉組織生氰糖苷降解途徑基因表達量及其編碼的酶活性的變化規(guī)律，以初步闡明生氰糖苷降解途徑基因表達影響木薯對二斑葉螨的抗性機制，為充分發(fā)揮固有次生代謝物質(zhì)在作物抗蟲中的作用，為木薯抗蟲種質(zhì)的挖掘及創(chuàng)新利用奠定理論和材料基礎。

?材料與方法

?材料

1.1.1? 供試木薯? 遺傳穩(wěn)定的抗螨木薯品種‘C1115’‘緬甸’和‘SC9’，以及感螨木薯品種‘SC205’‘面包’和‘BRA900’均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家木薯種質(zhì)資源圃提供。

1.1.2? 供試二斑葉螨? 二斑葉螨為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室在室內(nèi)以豇豆長期繼代飼養(yǎng)的試驗種群。飼養(yǎng)條件為：溫度（28±2）℃，相對濕度為75%±5%，光照為L∶D=16?h∶8 h。選擇發(fā)育歷期相同、大小一致的雌成螨進行后續(xù)試驗。

1.1.3? 試劑? RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司（中國），cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自上海吐露港生物科技有限公司，用于生氰糖苷降解酶活性測定的酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自于Mlbio公司（中國）。

? 方法

1.2.1 ?二斑葉螨的接種與樣品采集? 分別選取室內(nèi)種植3個月，長勢一致，健康的抗螨木薯品種‘C1115’‘緬甸’和‘SC9’，以及感螨品種‘SC205’‘面包’和‘BRA900’。每株木薯分別選取對應的上、中、下3個不同部位的3張葉片。挑選發(fā)育一致的二斑葉螨雌成螨，按50頭/葉的數(shù)量接種于葉背，以羊毛脂涂抹在葉柄基部防止二斑葉螨逃逸。采集未受螨害的健康植株葉片（0 d）、螨害1、4?d后不同部位的葉片樣品用于RNA和酶液提取。每個木薯品種的不同取樣部位、不同螨害時間均設置3個生物學重復。

1.2.2? 生氰糖苷降解途徑基因轉(zhuǎn)錄水平分析 ?提取不同螨害時間、不同部位葉片的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計（Thermo）檢測RNA的完整性和純度。取1.0 μg經(jīng)gDNA Eraser（TOLOBIO公司）去除gDNA后的RNA樣品用于cDNA合成。以木薯的基因作為內(nèi)參，相關基因的引物序列信息如表1所示。qPCR反應條件如下：95℃預變性30?s之后，循環(huán)反應采用40個循環(huán)：95℃變性10 s、60℃退火30?s，溶解曲線采集程序使用儀器默認的方法進行。

1.2.3? 生氰糖苷降解途徑關鍵酶的活性測定 ?生氰糖苷降解途徑關鍵酶α-HNL、β-GLU的活性測定方法參照上海Mlbio公司的植物α-HNL、β-GLU活性酶聯(lián)免疫試劑盒的說明書（https：//www. mlbio.cn/）。

? 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計學軟件DPS（V15.10）對不同植株部位受螨害不同時間后生氰糖苷降解途徑基因表達量的差異進行方差分析和多重比較，首先對原始數(shù)據(jù)的方差齊性進行檢驗，若方差齊性則采用Duncan’s新復極差法方法進行多重比較;若方差不齊則對數(shù)據(jù)進行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，并采用Dunnett’s T3方法進行數(shù)據(jù)間的多重比較（=0.05）。

?結(jié)果與分析

?抗、感螨木薯品種受螨害后生氰糖苷降解途徑基因的表達差異分析

與螨害前相比，抗、感螨木薯品種不同部位葉片受螨害不同時間后，生氰糖苷降解途徑基因的表達量表現(xiàn)出截然不同的變化趨勢。在上部葉片中，感螨木薯‘BRA900’中的表達量隨螨害時間延長逐漸降低，抗螨木薯‘C1115’中則隨螨害時間延長逐漸升高，而感螨木薯‘SC205’‘面包’和抗螨木薯‘緬甸’‘SC9’中的表達量均呈先顯著升高后降低到為害前水平的趨勢（<0.05），并且在抗螨木薯中受螨害后的表達量相對螨害前的提高幅度高于感螨木薯（圖2A）。在中部葉片中，3個感螨木薯品種‘BRA900’‘SC205’‘面包’的表達量均隨螨害時間的延長顯著降低，而在3個抗螨木薯品種‘C1115’‘緬甸’和‘SC9’中的表達量均隨螨害時間的延長而顯著提高（<0.05）（圖2B）。在下部葉片中，在所有抗、感螨木薯品種中的表達量均隨螨害時間的延長而顯著提高（<0.05），并且在3個抗螨木薯品種中的提高幅度大于感螨木薯品種（圖2C）。

抗、感螨木薯品種受螨害后生氰糖苷降解途徑基因的表達差異分析

對于另一個生氰糖苷降解途徑基因而言當以1.0 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA原液為模板（2 μL模板量，20 μL的反應體系）時，絕大多數(shù)樣品中該基因的熒光信號值仍然很低（CT>35），僅有個別樣品能被檢測到，難以比較抗、感木薯品種不同植株部位樣品受螨害不同時間后該基因表達量的變化情況。但在能檢測到信號的少量樣品中，抗螨木薯品種的占比高于感螨木薯品種（圖3）。

? 抗、感螨木薯品種受螨害后生氰糖苷降解酶的活性差異分析

與螨害前相比，抗螨木薯品種受螨害后，不同部位葉片的α-HNL酶活性總體上表現(xiàn)出升高或維持不變的趨勢（‘C1115’‘SC9’的中部葉片除外），而感螨木薯品種不同部位葉片的α-HNL酶活性呈逐漸降低的趨勢（‘BRA900’‘面包’的上部葉片除外），這與螨害前后基因表達量的變化趨勢并不完全一致。此外，對于相同植株部位，相同的螨害時間處理，抗螨木薯品種的α-HNL酶活性總體上顯著高于感螨木薯品種（<0.05）（表2）。

抗、感螨木薯品種受螨害后生氰糖苷降解酶的活性差異分析

與螨害前相比，抗螨木薯品種‘C1115’受螨害后，不同部位葉片的β-GLU酶活性均呈顯著提高的趨勢，而抗螨木薯品種‘緬甸’和‘SC9’的β-GLU酶活性則呈先比螨害前顯著提高（1?d）后又恢復到螨害前水平的趨勢（4?d）。感螨木薯

品種‘SC205’的β-GLU酶活性在螨害后顯著降低，而感螨木薯品種‘BRA900’和‘面包’的β-GLU酶活性則呈先比螨害前顯著提高（1?d）后又顯著低于螨害前水平的趨勢（4?d）（<0.05）。此外，對于相同植株部位，相同的螨害時間處理，抗螨木薯品種的β-GLU酶活性總體上顯著高于感螨木薯品種（表3）。

?討論

生氰糖苷能否發(fā)揮抗蟲功能，除了含量高低以外，還取決于其降解釋放出有毒的氫氰酸的能力大小，而生氰糖苷降解途徑基因和在生氰糖苷對害蟲的致毒過程中發(fā)揮重要作用。氫氰酸是一種強力的呼吸抑制劑和酶抑制劑，能夠?qū)οx產(chǎn)生毒害作用，從而發(fā)揮作物的抗蟲功能。許多植物也在長期的進化過程中產(chǎn)生了生氰物質(zhì)。例如ZAGROBELNY等研究植物-昆蟲互作時發(fā)現(xiàn)，生氰糖苷在β-GLU酶催化下導致氰醇、酮化合物或醛、HCN、β-氰基丙氨酸、硫氰酸鹽和亞硫酸鹽的積累，而上述化合物均與作物抗蟲性相關。CAIRNS等發(fā)現(xiàn)三葉草當中的亞麻苦苷（linamarin）、高粱中的蜀黍苷（dhurrin）和櫻桃以及其他核果中的野黑櫻苷（prunasin）能夠被α-HNL酶降解為有毒的氰化物，從而對害蟲產(chǎn)生毒害作用。丁梅等在研究橡膠樹基因時發(fā)現(xiàn)，橡膠樹被病蟲害侵染后，體內(nèi)的基因表達量顯著提升，而基因在橡膠樹不同組織中的表達量有所不同，其中在初生乳膠中的表達量遠遠高于次生乳膠，在幼嫩葉片中也高于成熟葉片。本研究結(jié)果表明，生氰糖苷降解基因在感螨木薯品種上部和中部葉片中的表達量隨螨害時間的延長顯著降低，而在抗螨木薯品種中則顯著提高，結(jié)合前人的研究，推測二斑葉螨與木薯長期的協(xié)同進化過程中，某些產(chǎn)生HCN能力較弱的木薯品種已經(jīng)被二斑葉螨所適應，成為其適宜寄主，而某些木薯品種，可能因其產(chǎn)生對害蟲有毒的HCN水平高，二斑葉螨不喜取食，成為其非適宜寄主，對二斑葉螨具有良好的抗性。

次生代謝物質(zhì)在植物中的含量具有組織特異性差異。董學奎研究水稻苯丙烷代謝物的時空分布時發(fā)現(xiàn)，水稻類黃酮物質(zhì)在葉中的含量最高，其次是莖稈、穗子與種子，而根中類黃酮物質(zhì)含量最低。劉亞軍在進行茶樹酯型兒茶素合成途徑及酚類物質(zhì)積累特異性研究時發(fā)現(xiàn)，同器官中酚類物質(zhì)組分及含量差異較大。在鮮葉和莖中的兒茶素、黃酮醇、酚酸含量較高。在木薯中，同樣存在生氰糖苷的組織特異性差異。例如周新成等采用高效液相色譜法分析木薯品種‘ARG7’‘KU50’和‘W14’的生氰糖苷含量時發(fā)現(xiàn)，3個品種葉片中生氰糖苷含量均達到塊根中的數(shù)倍以上。另有研究指出，α-HNL酶主要存在于木薯葉片中，在塊根中含量極少，甚至檢測不到。此外，還可以通過轉(zhuǎn)基因手段調(diào)控次生代謝物質(zhì)在植物體內(nèi)的分布狀況。例如郭海霞等研究發(fā)現(xiàn)糖苷生物堿在抵御病菌和害蟲侵襲方面有重要的作用，并且可以通過分子方法促進馬鈴薯地上部分糖苷生物堿（SGAs）的積累，提高其抗逆性和品質(zhì)。SIRITUNGA等在木薯葉片中特異表達生氰糖苷合成基因的反義片段，最終獲得葉片和塊根生氰糖苷含量分別降低94%和99%的轉(zhuǎn)基因后代。J?RGENSEN等對生氰糖苷合成基因進行RNA干涉，也獲得了木薯塊根氰苷含量極顯著降低的轉(zhuǎn)基因植株。NARAYANAN等用塊根特異性啟動子patatin啟動HNL過量表達，獲得的轉(zhuǎn)基因塊根在其加工過程中可加速HCN的揮發(fā)，從而降低了木薯食品由于處理不完全而殘留氰化物對人體造成的危害。本研究發(fā)現(xiàn)，受二斑葉螨為害后，和的表達量及其酶活力在抗螨木薯品種不同部位葉片呈逐漸升高或維持不變的趨勢，而在感螨木薯品種不同部位葉片中，和處于顯著被抑制或不能激活誘導的狀態(tài)，推測抗螨木薯品種可能具有更強的對害螨釋放有害HCN的能力。

基因轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢并不一定與蛋白水平的變化趨勢一致。基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加，而蛋白表達量減少，或者二者趨勢相反的案例已有較多報道。有研究指出，蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組學在分析中會存在差異，例如MAIER等在研究中發(fā)現(xiàn)，單個蛋白質(zhì)的半衰期是高度可變的，這種蛋白質(zhì)半衰期的差異已經(jīng)被證明是轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組結(jié)果之間存在分歧的原因，因此，轉(zhuǎn)錄組水平并不總與蛋白組水平一致，且蛋白水平分析比轉(zhuǎn)錄水平更能體現(xiàn)出植物體的相關功能變化。本研究結(jié)果表明，抗螨木薯品種受螨害后，不同部位葉片的α-HNL酶活性總體呈升高或維持不變的趨勢，而感螨木薯品種的酶活性總體上呈逐漸降低的趨勢，這與抗螨木薯品種表達量逐漸升高趨勢略有區(qū)別。而基因表達量很低，也導致其編碼的β-GLU酶活性也較低（實際檢測時酶液用量提高3倍才能保障酶活在試劑盒的檢測限內(nèi)），總體而言，在不同植株部位上，抗螨木薯品種的β-GLU酶活性總體顯著高于感螨木薯品種。上述結(jié)果從酶學水平進一步印證了我們的推斷，即抗螨木薯品種具有更強的降解和釋放有毒的氫氰酸抵御螨害的能力。

本研究僅從生氰糖苷降解途徑基因轉(zhuǎn)錄水平和酶活性水平層面初步闡述了木薯對二斑葉螨的抗性機制，而二斑葉螨為害前后，不同抗螨木薯品種的生氰糖苷含量，以及氫氰酸釋放量的差異尚未進行測定，其與基因表達和酶活性水平是否具有一致性，及其與木薯品種對二斑葉螨抗性的相關性尚不清楚，上述疑問仍需后續(xù)試驗進一步探究。

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