楊秀坤　沈文濤　庹德財(cái)　王赫　言普　黎小瑛　朱國(guó)鵬　周鵬

摘? 要：番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus， PLDMV）是一種新的潛在威脅番木瓜種植業(yè)的病毒，其輔助成分蛋白酶（helper component- proteinase， HC-Pro）是PLDMV編碼參與病毒復(fù)制、運(yùn)動(dòng)、寄主植物癥狀表現(xiàn)的多功能蛋白，因此純化獲得具有功能活性的HC-Pro蛋白，研究其多功能性具有重要意義。本研究利用In-Fusion拼接策略和E.coliCell-Free快速構(gòu)建植物病毒侵染性克隆法，一步快速地將28個(gè)氨基酸組成的蛋白標(biāo)簽Twin-Strep插入到PLDMV HC-Pro氨基端，成功獲得了基于農(nóng)桿菌的攜帶Twin-Strep標(biāo)簽的PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep。通過農(nóng)桿菌滲透注射接種番木瓜植株，從感染PLDMV-Strep的番木瓜葉片總蛋白中，利用Twin-Strep蛋白標(biāo)簽親和層析分離純化獲得PLDMV HC-Pro蛋白，并通過LC/ESI-MS/MS（liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometric）對(duì)其進(jìn)行蛋白N端和C端序列測(cè)序，證明了純化獲得完整的PLDMV HC-Pro蛋白。研究結(jié)果為后續(xù)解析PLDMV HC-Pro在病毒侵染過程中的功能及與寄主蛋白相互作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番木瓜畸形花葉病毒;HC-Pro;馬鈴薯Y病毒;蛋白純化中圖分類號(hào)：S436.67 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Purification of the Potyviral Helper Component-proteinase Using Agroinfection-compatible Twin-Strep-tagged Infectious cDNA Clone of Papaya Leaf Distortion Virus

YANG Xiukun SHEN Wentao TUO Decai WANG He YAN Pu LI Xiaoying ZHU Guopeng ZHOU Peng

1. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory of Quality Control of Tropical Horticultural Crops of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Papaya leaf distortion mosaic virus （PLDMV， genus Potyvirus） is an emerging threat to papaya production. The helper component proteinase （HC-Pro） encoded by potyvirus is a multifunctional protein involved in different steps of the viral cycle including aphid-vector transmission， virus replication and movement， cleavage of the polyprotein and suppression of RNA silencing. To enable the study of HC-Pro functions， high quantities of protein are required. Here we describe the construction of a PLDMV infectious clone that produces HC-Pro protein with a Twin-Strep-tag fused at the N-terminus， and the development of an efficient method to purify large amounts of PLDMV HC-Pro protein for the virus-infected papaya plants. To construct an agroinfection-compatible Twin-Strep-tagged PLDMV infectious cDNA clone designated pPLDMV-Strep， the previously constructed pPLDMV-WT plasmid that contained the full-length cDNA of the wild-type PLDMV genome was used as the template to amplify two DNA fragments containing all PLDMV viral sequences， the backbone of binary vector pGreenII-35S and Twin-Strep-tag by PCR with specific two primer pairs. Then， both PCR amplified fragments were assembled to produce the pPLDMV-Strep vector using one-step In-Fusion Cloning. Based on theEscherichia coliCell-Free method， the pPLDMV-Strep were directly transformed intoAgrobacterium tumefaciensto prevent potential problems such as plasmid instability during propagation inE. coli. Sequencing of the PCR products fromA.tumefaciens transformants confirmed that the full-length viral sequences in pPLDMV-Strep was identical to that of the wild-type PLDMV isolate and the Twin-Strep-tag was introduced correctly into N-terminus of the PLDMV HC-Pro. The agroinoculated papaya seedlings withA. tumefaciens transformant harboring the plasmid pPLDMV-Strep developed systemic mosaic symptoms on leaves at 20 days post inoculation （dpi） which were similar to those caused by wild-type PLDMV. The results suggested that the PLDMV-Strep was infectious and insertion of Twin-Strep-tag into PLDMV genome did not affect the viral infectivity. Furthermore， a protocol for purifying rapidly the PLDMV HC-Pro from PLDMV-Strep-infected papaya leaves based on the Strep-tag-Tactin@XT affinity chromatography was developed. the N- and C-terminal peptides from the purified Twin-Strep-tagged HC-Pro were identified by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometric （LC/ESI-MS/MS） analysis. Compared to previous several potyviral HC-Pro heterologous expression systems in baculovirus， yeast orE. coli，a major advantage of the expression system based on the agroinfection-compatible strep-tagged infectious cDNA clone was capable of producing more authentic HC-Pro proteins because purified PLDMV HC-Pro was from the virus-infected host plants. The results would provide a rapid and low-cost alternative method to obtain biologically active PLDMV HC-Pro protein and will facilitate to further study the structure and multifunction of PLDMV HC-Pro.

Keywords： Papaya leaf distortion mosaic virus; HC-Pro;Potyvirus; protein purification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.004

馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）是目前最大的植物RNA病毒屬，寄主范圍十分廣泛，是世界范圍內(nèi)危害多種糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物和果樹最嚴(yán)重的病毒屬之一。輔助成分蛋白酶（HC-Pro）是Potyvirus病毒編碼一個(gè)重要多功能病毒蛋白，在病毒的侵染循環(huán)過程中，通過與多種寄主蛋白互作發(fā)揮重要功能^[1-2]，主要包括：協(xié)助病毒蛋白前體的加工，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因沉默，參與病毒的長(zhǎng)距離移動(dòng)，輔助蚜傳，調(diào)控癥狀的形成，參與病毒的復(fù)制等^[2-4]。HC-Pro的三級(jí)結(jié)構(gòu)可以明顯的分為3部分：羧基末端（C-terminal， C端）部分、中間區(qū)域、氨基末端（N-terminal， N端）部分，C端和N端有大約100個(gè)氨基酸，中央?yún)^(qū)有250個(gè)氨基酸左右，每個(gè)區(qū)域都存在不同功能的氨基酸保守基序^[2]。N端區(qū)域含有豐富的半胱氨酸，該區(qū)域包括1個(gè)類似鋅指結(jié)構(gòu)的金屬結(jié)合基序，其中的KITC保守結(jié)構(gòu)域是蚜蟲傳播必需區(qū)域^[5]，N端區(qū)域主要參與病毒基因組的擴(kuò)增、病毒的蚜傳以及癥狀的形成等過程。中間區(qū)域可以參與病毒基因組的復(fù)制和長(zhǎng)距離移動(dòng)，同時(shí)還可以調(diào)控RNA沉默抑制活性以及與其他病毒的協(xié)生過程^[6]。純化獲得具有功能活性的HC-Pro蛋白，研究其多功能性具有重要意義。目前表達(dá)HC-Pro的系統(tǒng)主要包括：大腸桿菌原核表達(dá)體系、酵母表達(dá)體系、重組桿狀病毒和植物病毒表達(dá)體系、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)體系和攜帶蛋白標(biāo)簽的HC-Pro病毒侵染性克隆系統(tǒng)。這些表達(dá)系統(tǒng)已被應(yīng)用于西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）、煙草蝕刻花葉病毒（Tobacco etch virus， TEV）、煙草脈斑病毒（Tobacco vein mottling virus， TVMV）、李痘病毒（Plum pox virus， PPV）、菜豆普通花葉病毒（Bean common mosaic virus， BCMV）等馬鈴薯Y病毒屬病毒的HC-Pro功能研究^[7-11]。

番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus， PLDMV， genus Potyvirus）于1954年在日本琉球群島的沖蠅首次被發(fā)現(xiàn)^[12]。在我國(guó)，一直以來番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ringspot virus， PRSV， genusPotyvirus）是威脅我國(guó)番木瓜種植業(yè)最為嚴(yán)重的病毒病害。2012年8月，本研究組在海南種植的‘華農(nóng)1號(hào)轉(zhuǎn)基因抗PRSV番木瓜果園檢測(cè)到PLDMV^[13-14]，病株表現(xiàn)出PRSV類似病癥（葉片褪綠，黃化，嵌紋，皺縮和畸形;葉柄及嫩莖上會(huì)產(chǎn)生水浸狀斑;果實(shí)上產(chǎn)生水漬狀斑點(diǎn)，造成果實(shí)甜度，口感和風(fēng)味下降，嚴(yán)重時(shí)可致果實(shí)畸形），極易被誤認(rèn)為感染PRSV，但2種病毒之間并無血清學(xué)關(guān)系^[12]。HC-Pro蛋白對(duì)于解析PLDMV的致病機(jī)理以及病情防控策略研究至關(guān)重要。目前還沒有純化PLDMV HC-Pro的相關(guān)研究，因此本研究通過構(gòu)建HC-Pro N端攜帶含28個(gè)氨基酸Twin-Strep標(biāo)簽的PLDMV全長(zhǎng)侵染性克隆pPLDMV-Strep侵染番木瓜植株，利用Twin-Strep蛋白標(biāo)簽親和層析分離純化PLDMV HC-Pro蛋白，為后續(xù)研究其在病毒的侵染過程中的功能及與寄主蛋白互作機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1? 植物材料與菌株? 本研究所采用的植物材料‘蜜紅番木瓜幼苗種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所溫室;野生型PLDMV侵染性克隆pPLDMV-WT由本研究組構(gòu)建^[15];農(nóng)桿菌GV3101（pSoup）感受態(tài)細(xì)胞采購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.2? 儀器與試劑? 使用TaKaRa公司的Prime?STAR^?Max DNA Polymerase進(jìn)行基因片段擴(kuò)增;產(chǎn)物回收試劑盒FastPure^?Gel DNA Extraction Mini Kit、菌液PCR鑒定Taq酶2×RapidTaqMaster Mix采購(gòu)自Vazyme公司;天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取，Thermo Scientific 公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA的合成;In-Fusion連接酶、DL5000 Marker以及DL15000 Marker均采購(gòu)于TaKaRa公司、德國(guó)IBA公司的Strep- Tactin^@XT親和層析柱進(jìn)行蛋白純化;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、彩色預(yù)染分子蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)等均購(gòu)置武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1? 引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增? 為了將Twin-Strep標(biāo)簽（WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQF EK）插入P1與HC-Pro酶切位點(diǎn)MYHY/SD之后的位置，構(gòu)建HC-Pro N端攜帶Twin-Strep標(biāo)簽的PLDMV侵染性克隆載體pPLDMV-Strep，本研究基于PLDMV-WT基因組全長(zhǎng)序列（GenBank accession no. JX974555），設(shè)計(jì)引物對(duì)Strep-HC-F / PLDMV9068-R和PLDMV9045-F / Strep-HC-R（表1），其中引物Strep-HC-F/R中均含有Twin- Strep部分編碼序列。分別利用這2對(duì)引物對(duì)，以pPLDMV-WT為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因片段I和II（圖1）。片段I包含7494 nt的PLDMV-WT核苷酸序列（第1575～9068 nt）和Twin-Strep標(biāo)簽N端編碼序列（第33～84 nt）;片段II包含2659?nt的PLDMV-WT核苷酸序列（第1～1574?nt，9069～10153 nt），Twin-Strep標(biāo)簽C端編碼序列序列（1～53?nt）和植物表達(dá)載體pGreenII-35S（KX826944）的骨架序列。PCR反應(yīng)體系為：模板0.5 μL，PrimeSTAR Max Premix（2×）25?μL，正反向引物各0.5?μL，ddH₂O 23.5?μL。PCR反應(yīng)程序如下：98℃預(yù)變性1 min;98℃變性10?s，55℃退火10?s，72℃延伸2?min 30?s，循環(huán)25次;72℃終延伸5 min。

1.2.2? In-Fusion拼接及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化鑒定? 按照In-Fusion試劑盒說明書，將上述PCR擴(kuò)增獲得的I和II進(jìn)行無縫克隆拼接，構(gòu)建 pPLDMV-Strep載體。反應(yīng)體系為：5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2?μL，I片段4?μL，II片段4?μL。反應(yīng)條件為：50℃，15?min。進(jìn)一步利用本研究組建立的E. coliCell-Free one step快速構(gòu)建植物病毒侵染性克隆法^[16]，將I和II的拼接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至含pSoup輔助質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，并利用引物對(duì)pldseq1081-F/pldseq3220-R（表1）進(jìn)行菌液PCR鑒定。菌液PCR反應(yīng)體系為：2×RapidTaqMaster Mix酶（Vazyme）10?μL，上下游引物各1?μL，菌液2 μL，ddH₂O 7?μL。PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15 s，50℃退火15 s，72℃延伸1?min，循環(huán)30次;72℃終延伸5?min。將鑒定為陽(yáng)性的單克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3? 滲透注射接種番木瓜植株? 將10?μL含測(cè)序正確的pPLDMV-Strep的農(nóng)桿菌加入到5?mL含卡那霉素（50?μg/mL）與利福平（20?μg/mL）抗性的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增培養(yǎng)，5000?r/min離心5?min后收集菌體，用農(nóng)桿菌接種緩沖液[10?mmol/L MgCl₂，2.50 mmol/L MES （pH=5.7）和100 μmol/L乙酰丁香酮（AS）]將菌液重懸至OD值為0.6，暗處理3?h以上，使用無針頭的注射器對(duì)番木瓜葉片進(jìn)行注射接種。同時(shí)以含有野生型番木瓜畸形花葉病毒pPLDMV-WT和pGreenII-35S空載體的農(nóng)桿菌菌株為對(duì)照進(jìn)行接種。對(duì)接種后的番木瓜植株進(jìn)行定期觀察，并記錄發(fā)病情況。

1.2.4? PLDMV RT-PCR鑒定? 取50～100 mg葉片按照天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取。提取RNA后采用Thermo Scientific 公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行cDNA的合成。以cDNA為模板，利用引物對(duì)pldseq1081-F/pldseq3220-R進(jìn)行PLDMV RT-PCR鑒定。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，2?PrimeSTAR^?Max DNA Polymerase 10?μL，正反向引物各0.5?μL，ddH₂O，7?μL。PCR反應(yīng)程序如下：98℃預(yù)變性1?min;98℃變性10?s，55℃退火15?s，72℃延伸30?s，循環(huán)25次;72℃終延伸2 min。

1.2.5? 番木瓜總蛋白粗提取及Strep-Tactin^@XT 親和層析? 取10?g病葉經(jīng)液氮充分研磨后加入30?mL蛋白提取緩沖液[100?mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），150 mmol/L KCl，10?mmol/L MgCl，10 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，1% P40，1% Protein inhibitor]。將研磨過后的樣品與蛋白提取緩沖液充分混勻后置于冰上冷卻30?min，將冷卻后的混合液以5000?r/min轉(zhuǎn)速離心30?min后，分別用0.45?μm和0.22?μm針頭過濾器將上清液過濾后得到粗提總蛋白液。最后參考德國(guó)IBA公司的Strep-Tactin^@XT層析柱說明書的方法和步驟對(duì)粗提蛋白液進(jìn)行親和層析。

1.2.6? SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)譜檢測(cè)? 取上述層析產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，切下目的蛋白膠條，首先利用50% ACN-50% 50?mmol/L NH₄HCO₃溶液脫色進(jìn)行膠粒脫色，分別取濃度為25?ng/μL的Asp和Trypsin兩種蛋白酶（用100?mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）稀釋）對(duì)目的蛋白分別進(jìn)行37℃水浴酶解16 h，酶解后獲得的樣品通過液質(zhì)聯(lián)用LC-ESI-MS/MS分析，得到質(zhì)譜原始結(jié)果經(jīng)過軟件Byonic分析，匹配數(shù)據(jù)，得到最終蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果（蛋白質(zhì)譜鑒定的操作流程由北京百泰派克生物科技有限公司完成）。

2? 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建pPLDMV-Strep所需拼接片段的克隆和In-Fusion拼接

以pPLDMV-WT為模板，分別利用引物對(duì)Strep-HC-F/PLDMV9068-R和PLDMV9045-F/ Strep-HC-R經(jīng)PCR擴(kuò)增構(gòu)建pPLDMV-Strep所需拼接片段I（7586?bp）和片段II（5998 bp），瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：在預(yù)期大小位置出現(xiàn)了拼接片段I和II的特異條帶。利用In-Fusion策略，將這上述2個(gè)片段I和II進(jìn)行拼接后，其產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示（圖2）：除了拼接片段I和II外，還出現(xiàn)了一條14?000?bp左右的基因片段與預(yù)期13?576?bp結(jié)果一致，說明I和II已成功拼接，其產(chǎn)物可進(jìn)一步進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

2.2 基于農(nóng)桿菌的pPLDMV-Strep侵染性克隆的構(gòu)建

將上述拼接片段I和II In-Fusion拼接產(chǎn)物進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。隨機(jī)挑選6個(gè)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子，利用引物pldseq1081-F和pldseq3220-R進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示：3～8號(hào)菌液均擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段（2223?bp）（圖3A）。選取3號(hào)泳道的菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：Twin-Strep標(biāo)簽序列正確的插入到了P1與HC-Pro酶切位點(diǎn)MYHY/SD后的位置（圖3B），閱讀框架無誤，成功拼接獲得了HC-Pro N端攜帶Twin-Strep標(biāo)簽的PLDMV侵染性克隆載體pPLDMV-Strep。

2.3? pPLDMV-Strep的侵染性分析

利用農(nóng)桿菌滲透注射技術(shù)，分別將含有pGreenII-35S、pPLDMV-WT、pPLDMV-Strep的農(nóng)桿菌滲透緩沖液注射到4～5葉期的番木瓜葉片。接種20?d后發(fā)現(xiàn)：在接種pPLDMV-Strep和pPLDMV的植株上的新葉均出現(xiàn)了典型的PLDMV病癥：斑駁的花葉，葉片輕微卷曲，莖桿呈現(xiàn)水漬狀的現(xiàn)象，而對(duì)照pGreenII-35S侵染的植株則無病癥出現(xiàn)（圖4A）。進(jìn)一步對(duì)感染了病毒的系統(tǒng)葉片Twin-Strep插入位置進(jìn)行RT-PCR和測(cè)序分析證明（圖4B），基于農(nóng)桿菌的pPLDMV-Strep侵染性克隆成功感染番木瓜植株，且Twin-Strep標(biāo)簽插入未影響其侵染性。

2.4 親和層析分離PLDMV HC-Pro

通過分別提取感染了PLDMV-Strep和PLDMV-WT的番木瓜葉片總蛋白，經(jīng)Strep- Tactin^?XT High Capacity親和層析柱純化獲得的層析產(chǎn)物，層析產(chǎn)物的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)（圖5），來自感染了PLDMV-Strep的樣品在55～ 72?kDa之間存在1條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期大小帶Twin-Strep標(biāo)簽的HC-Pro（Strep-HC-Pro）（56.5?kDa）一致，而無Twin-Strep標(biāo)簽PLDMV-WT感染樣品對(duì)照則無任何條帶產(chǎn)生，初步推測(cè)來自感染PLDMV-Strep樣品層析產(chǎn)物在55～ 72?kDa之間出現(xiàn)的特異蛋白條帶為Strep-HC-Pro。

2.5? Strep-HC-Pro N/C端序列分析

進(jìn)一步利用LC/ESI-MS/MS對(duì)感染PLDMV- Strep樣品層析產(chǎn)物在55～72 kDa之間出現(xiàn)的特異蛋白條帶進(jìn)行蛋白N/C端測(cè)序，二級(jí)質(zhì)譜圖結(jié)果表明，該條帶N端氨基酸序列（WSHPQFEK）與Twin-Strep標(biāo)簽N端氨基酸序列一致（圖6A），C端氨基酸序列（DSEMKHYLVG）與PLDMV HC-Pro C端氨基酸序列一致（圖6B）。因此可以確定，利用攜帶Twin-Strep標(biāo)簽PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep能夠成功分離純化出大小完整的PLDMV HC-Pro。

3? 討論

侵染性克隆是研究病毒的基因功能、侵染機(jī)理、病毒-宿主互作最為重要的基礎(chǔ)研究工具。PLDMV-WT基因組全長(zhǎng)為10 153 nt，對(duì)于較大的病毒而言，如果使用傳統(tǒng)侵染性全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建法，將會(huì)擴(kuò)增得到短的病毒片段，選擇合適限制性內(nèi)切酶，使用連接酶將這些片段逐步組裝成質(zhì)粒載體等繁瑣的亞克隆步驟^[16-18]?；谙拗菩詢?nèi)切酶和連接酶的病毒侵染性克隆構(gòu)建方法耗時(shí)費(fèi)力，連接效率低^[19]。In-Fusion克隆技術(shù)通過識(shí)別目標(biāo)DNA片段和線性化載體末端的15 bp同源序列將DNA片段和線性化載體高效地融合，該過程不需要使用任何限制性內(nèi)切酶、連接酶。因此，本研究利用In-Fusion策略，將末端具有15個(gè)同源堿基的片段I（含有7586 nt PLDMV）和片段II（含2567 nt PLDMV和pGreenII-35S骨架序列）進(jìn)行拼接，一步快速獲得預(yù)期大小的侵染性克隆pPLDMV-Strep。

較大的病毒基因組全長(zhǎng)在克隆到大腸桿菌宿主細(xì)胞進(jìn)行侵染性克隆的過程中，經(jīng)常導(dǎo)致病毒基因組全長(zhǎng)在大腸桿菌宿主細(xì)胞中出現(xiàn)基因片段缺失、重組、突變等不穩(wěn)定現(xiàn)象^{[15， 20-21]}，致使侵染性克隆構(gòu)建失敗，而產(chǎn)生這種現(xiàn)象被報(bào)道與病毒基因組編碼的病毒蛋白對(duì)大腸桿菌有毒性有關(guān)。本研究為了避免PLDMV在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性，利用E. coli Cell-Free one step快速構(gòu)建植物病毒侵染性克隆法避開大腸桿菌轉(zhuǎn)化過程^[15]，直接將包含pPLDMV-Strep侵染性克隆的2個(gè)片段（I和II）In-Fusion拼接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌，成功獲得了與野生型PLDMV-WT一樣對(duì)番木瓜植株具有侵染性的攜帶Twin-Strep標(biāo)簽PLDMV侵染性克隆pPLDMV-Strep，為利用Twin-Strep蛋白標(biāo)簽親和層析分離純化PLDMV HC-Pro蛋白奠定基礎(chǔ)。

與已報(bào)道的利用大腸桿菌原核表達(dá)體系、酵母表達(dá)體系、重組桿狀病毒、植物病毒表達(dá)體系和轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)體系等表達(dá)、分離純化不同Potyvirus成員HC-Pro相比，本研究采用攜帶蛋白標(biāo)簽的HC-Pro病毒侵染性克隆系統(tǒng)分離純化PLDMV HC-Pro優(yōu)點(diǎn)有：（1）通過病毒感染原宿主分離獲得的病毒蛋白能真實(shí)地反映出病毒蛋白的結(jié)構(gòu)、功能特點(diǎn)和生物活性;（2）有效避免原核表達(dá)體系可能產(chǎn)生的不溶性包涵體和其他異源表達(dá)可能產(chǎn)生的錯(cuò)誤翻譯后加工，從而影響后續(xù)功能分析。例如利用重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)TVMV HC-Pro，獲得的HC-Pro雖然具有蛋白酶活性但卻失去了蚜蟲傳播活性^[7]。2004年RUIZ-FERRER等^[9]利用酵母真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)TEV HC-Pro，表達(dá)量達(dá)到了0.7?mg/L，但蚜蟲傳播生物活性較低。2011年FUELLGRABE等^[10]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ZYMV HC-Pro，可能由于蛋白表達(dá)量高或是缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類而產(chǎn)生了不溶性包涵體。

HC-Pro是Potyvirus病毒蛋白中功能最多且最復(fù)雜的一種，它參與病毒復(fù)制、細(xì)胞間系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)、寄主植物癥狀表現(xiàn)及抑制寄主植物的基因沉默效應(yīng)等^[22-23]。HC-Pro的多功能性預(yù)示著它們與寄主植物蛋白因子間的相互作用在病毒致病及植物防御過程中起重要作用，目前已報(bào)道與HC-Pro互作的寄主蛋白多達(dá)20余種，包括翻譯起始因子eIF4E/iso4E、環(huán)指蛋白HIP1、葉綠體蛋白質(zhì)NtMinD、番木瓜鈣網(wǎng)蛋白PaCRT、轉(zhuǎn)錄因子RAV2等^[24-27]。另外，HC-Pro可通過與21?nt和22?nt病毒來源的siRNAs（virus-derived small interfering RNAs）雙鏈分子的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex， RISC）形成，是病毒抑制植物基因沉默的一種重要反防御途徑^[3]。因此，本研究利用攜帶Twin-Strep標(biāo)簽PLDMV侵染性克隆分離獲得的PLDMV HC-Pro將為后續(xù)研究其與寄主蛋白和siRNAs相互作用奠定基礎(chǔ)。

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