尹玉瑩　房林　李琳　陳硯　符穩(wěn)群　吳坤林　曾宋君

摘? 要：兜蘭由于獨特的花朵造型、絢麗的花朵色彩、持久的觀賞花期而具有極高的觀賞價值，是國際上的高檔花卉。但由于生態(tài)環(huán)境的破壞以及人們對其過度采挖，兜蘭現(xiàn)已成為世界上最瀕危的植物物種之一，許多種類已瀕臨滅絕，所有兜蘭野生種均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄I而被禁止交易。目前，市場上流行的兜蘭品種大多是由臺灣等地利用無菌播種獲得的雜交種或少量原生種，但由于兜蘭屬植物的生長習性復雜、生長周期長、花期種間差異大，至今尚無有效的花期調(diào)控技術(shù)。兜蘭為典型的合軸生長方式，花芽產(chǎn)生于每年開花前后從基部分蘗出的新側(cè)芽。兜蘭屬植物為總狀花序，具多花原基，多花種類（或品種）的副花同時或先后發(fā)育;單花種類（或品種）是由于副花花芽分化后停止發(fā)育所引起的。開花時間與開花豐度是2個非常重要的園藝性狀。光照、溫度、植物生長調(diào)節(jié)劑和肥料是影響植物開花的主要因素。對于主要分布在熱帶地區(qū)的兜蘭屬植物而言，光周期對其花期的影響不顯著;溫度是促進春花型兜蘭從營養(yǎng)生長進入生殖生長的關(guān)鍵因素;赤霉素（GA）和6-芐基嘌呤（6-BA）單獨施用或結(jié)合施用均可以有效調(diào)控花期，一些單花種類利用植物生長調(diào)節(jié)劑可促進單花類的副花發(fā)育形成雙花或多花;開花前定期噴施低濃度的含高磷高鉀的水溶肥也可以有效提前花期。本文在對兜蘭屬植物生長習性、花芽分化方式和花期調(diào)控技術(shù)等相關(guān)研究進行綜合分析的基礎(chǔ)上，參考其他蘭花花期調(diào)控的方法，提出了兜蘭屬植物花期調(diào)控技術(shù)及分子機制的主要研究方向，以期為兜蘭屬植物的花期調(diào)控及兜蘭商品化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：兜蘭;生長習性;花芽分化;花期調(diào)控中圖分類號：S682.31 ?????文獻標識碼：A

Advances in Flowering Regulation of

YIN YuyingFANG LinLI LinCHEN XianFU WenqunWU KunlinZENG Songjun

1. Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China; 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany， South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510650， China; 4. Yunfu Renshan Chengtou Agricultural Development Co.， Ltd.， Yunfu， Guangdong 527300， China; 5. Department of Biological Science & Technology， Minnan Normal University， Zhangzhou， Fujian 363000， China

species， popularly known as slipper orchids because of the resemblance of the pouch-shaped lip to a lady’s slipper， gorgeous flower color and long-lasting flowering， have captured the interest of many orchid growers and hobbyists and are one of the most popular and rare orchid genera being sold and exhibited today. Wild populations are under the threat of extinction as a result of over-collection， loss of suitable habitats， and all species are listed in the Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora （CITES） Appendix I and the trade is prohibited. At present， most of the popular species on the market are hybrids or a small number of native species obtained by asymbiotic seed germination in Taiwan and other places. Due to its long growth cycle， large differences among species and diverse flowering habits， it is difficult to achieve effective flowering regulation. has a sympodial habit of growth. After blooming， the plant will resume growth at the base of the previous shoot. The apical meristem of each new growing shoot continually differentiates its leaves until it initiates flower buds under proper environmental conditions. The is a raceme with polyfloral primordia. The dominant flower and lateral flower （s） of polyfloral species or varieties develope simultaneously or successively. However， the single flower species or varieties are caused by the cessation of development of lateral flower buds after differentiation. Flowering time and flowering abundance are two very important horticultural traits. Light， temperature， plant growth regulators and fertilizers are the main factors affecting plant flowering. For the species mainly distributed in tropical regions， the photoperiod has no significant effect on the flowering period. Temperature is a key factor to promote the growth of spring-flowered from vegetative growth to reproductive growth. Gibberellin （GA） and 6-benzylpurine （6-BA） alone or in combination can effectively control the flowering period. The use of plant growth regulators in some monofloral species could promote the development of lateral flowers to form double or multiple flowers. Regular spraying of low-concentration water-soluble fertilizers containing high phosphorus and high potassium before flowering can also effectively advance the flowering period. This article reviews the related researches on the growth habit， flower bud differentiation and flowering regulation technology of . With reference to other methods of orchid flowering period regulation， suggestions for flowering regulation are put forward in order to provide reference for the research on the flowering regulation technology and the commercial production of .

; growth habit; flower bud differentiation; flowering regulation

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.013

兜蘭是蘭科（Orchidaceae）兜蘭屬（ Pfitzer）植物的統(tǒng)稱，其顯著特征為唇瓣特化成兜狀或拖鞋狀，頗似女性的拖鞋，故又稱為“拖鞋蘭”或者“仙履蘭”等。兜蘭屬植物花型奇特、花色艷麗、花期長，具有極高的觀賞價值。目前兜蘭生產(chǎn)已由趣味栽培轉(zhuǎn)為商業(yè)栽培，除了作為高檔盆花廣受人們喜愛以外，也逐漸進入切花市場，兜蘭也將成為繼蝴蝶蘭之后又一需要高技術(shù)、具有高經(jīng)濟價值的花卉代表。由于過度采集和棲息地的破壞，大部分野生兜蘭處于瀕臨滅絕的困境，所有野生種類均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）的附錄I中并禁止交易。因此市場上流行的兜蘭大多為人工栽培的雜交種，以斑葉單花魔帝型（Maudiae type）及綠葉單花的復合雜交品系標準型（Complex type）為主流，多花型兜蘭的數(shù)量較少。但由于雜交種無菌播種后其后代性狀會發(fā)生分離，品質(zhì)不穩(wěn)定，花期不一致，難以按計劃進行規(guī)?；a(chǎn)，特別是兜蘭的無性克隆技術(shù)還不成熟，難以獲得遺傳背景一致的商品雜交種用于花期研究，嚴重阻礙了兜蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，兜蘭規(guī)?；耘喑潭容^低，不同種類或品種由于遺傳背景的差異對環(huán)境條件的要求不同，難以實行統(tǒng)一的栽培管理方法，盡管已有一些兜蘭栽培和花期調(diào)控研究的報道，但由于采用傳統(tǒng)蘭花的水肥栽培和自然開花的生產(chǎn)模式，尚無有效且精準的花期調(diào)節(jié)技術(shù)使其應(yīng)節(jié)開花。本文對兜蘭屬植物生長習性、花芽分化和花期調(diào)控技術(shù)的研究進展進行綜述，參考其他蘭花花期調(diào)控的方法，提出兜蘭屬植物花期調(diào)控的研究方向及建議。

兜蘭的生長習性

兜蘭為多年生草本植物，葉近基生，呈2列排列于短縮的莖上，莖下端與短縮的根狀莖相連接。全屬約有109種，主要分布于熱帶亞洲，從印度向東跨越中國南部到菲律賓和整個東南亞和馬來群島新幾內(nèi)亞和所羅門群島。我國兜蘭屬植物種質(zhì)資源豐富，主要分布于西南和華南地區(qū)，約有27個種。大多數(shù)兜蘭屬植物生于地面或積土的巖石表面或巖縫中，較少數(shù)著生于樹上。兜蘭為典型的合軸（sympodial）生長方式，每年開花前后會從基部分蘗出新的分蘗芽，分蘗芽進一步生長發(fā)育并開花。其開花習性多樣，在自然光照和溫度的溫室栽培條件下，同色兜蘭（）一年四季都能開花，而胼胝兜蘭（）只能在4—5月開花，長瓣兜蘭（）則主要在7—9月開花，波瓣兜蘭（）的花期集中于10—12月。

兜蘭的花芽分化

兜蘭屬植物的花序軸一般可著生1～15朵花。多花短瓣組（Sections ）、多花長瓣組（Sect. ）和多花無耳組（Sect. ）為多花的總狀花序，通常具3朵或3朵以上花，同時開放或相繼開放;其余種常為單花，但所有單花種都孕育有1個以上敗育花芽在其頂端苞片處，在適宜的條件下，這些花芽也能開放形成雙花或多花現(xiàn)象。如白旗兜蘭（）在正常栽培條件下多為單花，偶爾會出現(xiàn)雙花。

皮秋霞等通過形態(tài)解剖研究了杏黃兜蘭（）成花的過程，發(fā)現(xiàn)杏黃兜蘭通常可以分化出2～3朵小花，但往往只有1朵花發(fā)育最早，最終開放，其他小花在發(fā)育過程中停止發(fā)育。通常情況下，杏黃兜蘭產(chǎn)生復雜花器官所用的時間僅為半個月或更短，而從花器官形成至花開放，則一般需要6～8個月左右的時間，即當年9月形成完整花芽，直到次年2—4月花開。此外研究發(fā)現(xiàn)杏黃兜蘭的分蘗芽集中于母株開花前后出現(xiàn)，母株一般產(chǎn)生1～2個分蘗芽。從營養(yǎng)物質(zhì)分配的角度來分析，在轉(zhuǎn)入生殖生長之前，杏黃兜蘭的營養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)先分配給母株的營養(yǎng)器官（葉片），供其生長，以同化、積累更多營養(yǎng)，至轉(zhuǎn)入生殖生長后，營養(yǎng)物質(zhì)主要分配給生殖器官，供其進行形態(tài)建成。只有在花已完成生長或開放后，分蘗芽才成為主要的營養(yǎng)分配庫，開始迅速生長分化，長出母體。CribB認為多花花序是杓蘭亞科中較為原始的特征，推測兜蘭屬植物可能在其進化過程中，不再需要通過多花表型來達到其繁殖的目的，因此其多花總狀花序不斷減退，養(yǎng)分集中于供應(yīng)單朵花的發(fā)育并產(chǎn)生新的分蘗芽，使有性繁殖與無性繁殖達到最優(yōu)分配。然而在實際生產(chǎn)中，往往豐花表型具有更高的商品價值。陳影通過對魔帝兜蘭（Maudiae）實生苗進行赤霉素處理，發(fā)現(xiàn)噴施赤霉素會出現(xiàn)一梗雙花現(xiàn)象，不同濃度（1、10、50、100 mg/L）處理的魔帝兜蘭，其總雙花率平均達10%，對照組無雙花。另外，在研究中也發(fā)現(xiàn)，大部分兜蘭種類開花后一般每年只能長出1個側(cè)芽用于第2年開放，但我們審定的園春兜蘭（× ）、迎春兜蘭（× ）等具有較強的分蘗能力，1個芽開放后能形成2～3個側(cè)芽，每個側(cè)芽第2年能開花，開花數(shù)多。因此，在研究過程中，一方面可以通過刺激未完全發(fā)育的小花繼續(xù)發(fā)育出來，形成一梗雙花或多花實現(xiàn)豐花表型;另一方面可以通過雜交育種的手段培育出分蘗能力強的雜交種實現(xiàn)豐花。

花期調(diào)控技術(shù)

?光照調(diào)控

光在植物的生長發(fā)育過程中極其重要。光質(zhì)、光強與光周期均能影響植物的光合作用進而影響植物的正常生長。在一些蘭科植物中已經(jīng)證明，成花誘導受光周期調(diào)控。Wang等研究認為，蝴蝶蘭（）在30℃/20℃（晝/夜）條件下，9 h光照比16 h光照更能有效地促進花芽萌發(fā)。Lopez等認為在低溫處理之前對盆栽堇花蘭（）進行4周或8周的短日照處理（光照時間9?h/d），可以極大地促進開花，開花量達到90%以上，而且出花整齊。然而對于主要分布在熱帶地區(qū)的兜蘭屬植物而言，光周期對其花期的影響不顯著。

?溫度調(diào)控

對于多年生熱帶低地蘭科植物而言，光周期對其開花的影響有限，環(huán)境溫度的變化可能在調(diào)控其花期的過程中起著更重要的作用。其中蘭科蝴蝶蘭屬（）植物為典型代表，生產(chǎn)上通過控制溫度調(diào)控花期，實現(xiàn)規(guī)模化種植，達到終年生產(chǎn)的目的。研究表明當日溫高于28℃時，花芽的萌動被抑制，使植株保持營養(yǎng)生長，當溫度低于26℃時，蝴蝶蘭可以完成成花誘導。除蝴蝶蘭外，低溫對石斛屬（）、美堇蘭屬（）、軛瓣蘭屬（）植物開花均有促進作用。張嘉滿等對兜蘭3個亞屬的8種材料進行較為系統(tǒng)的花期調(diào)控研究，分析了日照長度、日夜溫度和植物生長調(diào)節(jié)劑等因素對兜蘭開花的影響，結(jié)果表明，促進兜蘭屬植物開花的可能因子，除單花品系之雜交種魔帝型（ Maudiae type）外，主要受溫度的調(diào)控。雜交種 Greyi和Magic Lantern于高溫環(huán)境30℃/25℃下開花率為0%，20℃/15℃環(huán)境下均有88%的開花率。另外晝/夜溫度25℃/15℃對原生種李氏兜蘭（）白旗兜蘭紅旗兜蘭（）和秀麗兜蘭（）均有良好的催花效果。對于兜蘭屬的模式種波瓣兜蘭而言，溫度誘導（thermo-induction）可以有效促進其開花，即當植株持續(xù)暴露在18℃左右的溫度下時，植株會無限期地保持在營養(yǎng)階段。然而，如果植物在接近12℃的溫度下有2～3周的溫度誘導期，然后再回到較高的溫度下，在很短的時間內(nèi)就會開花。另外，Cribb也提出夜溫的顯著降低能促進多花的羅氏兜蘭（）提前開花。

綜上，結(jié)合兜蘭的原產(chǎn)地來看，兜蘭屬植物主要分布在熱帶亞洲。其中在馬來西亞、新加坡和印度尼西亞等地，季節(jié)性的暴風雨引起的溫度下降可能是影響兜蘭開花的主要因素。因此，可以通過空調(diào)溫室調(diào)控晝夜溫度或高山催花的方式探索影響兜蘭開花的溫度條件。

? 植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控

在實際生產(chǎn)過程中，溫度與光照控制具有高消耗、高成本、難度大的特點。而植物激素作為影響植物開花的重要因素，外施植物生長調(diào)節(jié)劑可部分取代光周期與溫度等環(huán)境因子的催花效果，且成本低，易操作，因此應(yīng)用廣泛。通常情況下，對于蝴蝶蘭屬和石斛屬植物而言，細胞分裂素刺激開花，而生長素會抑制細胞分裂素的作用，赤霉素單獨應(yīng)用時效果不明顯，但與細胞分裂素聯(lián)合使用時效果略有提高。雖然赤霉素無法誘導開花，但外施赤霉素可以逆轉(zhuǎn)蝴蝶蘭高溫下無法開花的表型，但會造成花朵畸形。細胞分裂素與赤霉素聯(lián)合使用，可改善畸形的發(fā)生。李秀玲等以帶葉兜蘭（P. hirsutissimum）和同色兜蘭為試驗材料，研究了2種兜蘭在不同發(fā)育時期葉片中內(nèi)源激素變化與開花的關(guān)系，結(jié)果表明，從大苗期到現(xiàn)葶期，帶葉兜蘭葉片中玉米素（ZT）含量顯著降低，GA和生長素（IAA）含量顯著升高。而同色兜蘭葉片中GA、脫落酸（ABA）和IAA的含量均下降，玉米素核苷（ZR）含量無明顯變化;從現(xiàn)葶期到初花期，帶葉兜蘭葉片中ZT的含量直線上升，GA的含量先降低后上升，IAA的含量急劇上升，GA/IAA的比值持續(xù)下降。同色兜蘭葉片中ZR含量呈先上升后下降再上升的趨勢，GA的含量變化不大，IAA和ABA含量先下降后上升，GA/IAA的比值持續(xù)上升。兜蘭從大苗期到現(xiàn)葶期，完成了從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變。從現(xiàn)葶期到初花期，涉及了花序和花器官的進一步發(fā)育。不同種兜蘭其內(nèi)源激素水平與其花芽分化的關(guān)系不盡相同。同色兜蘭是兜蘭屬中較易種植、較易開花的種，一年四季都能開花，通常具1～2朵花，少數(shù)具3朵花。帶葉兜蘭為兜蘭屬中典型的春花型兜蘭，于每年春季4—5月開花，通常單花。對于春花型帶葉兜蘭而言，現(xiàn)葶期葉片中GA含量（36.95?μg/g）顯著高于大苗期GA含量（6.19?μg/g），說明帶葉兜蘭花朵形態(tài)建成需要更高水平的GA含量。對比雙花同色兜蘭和單花帶葉兜蘭從現(xiàn)葶期到初花期葉片中激素含量的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，兜蘭葉片中GA和IAA的含量可能影響了花序的進一步發(fā)育，進而決定了開花數(shù)量和花朵品質(zhì)。赤霉素對于兜蘭屬植物抽梗開花有促進作用，但不同種對赤霉素的濃度要求不同。陳俊成使用赤霉素GA與GA，可誘導Maudiae type開花，濃度以100 mmol/L的效果最好，但使用赤霉素會造成花梗不正常彎曲，整體花型不對稱，上萼片內(nèi)卷，形狀變狹長，花瓣卷曲，子房變長等畸形花問題。Miguel等對4年生未開花的雜交種實生苗（Macabre × ）進行噴施GA實驗發(fā)現(xiàn)，866 mmol/L GA使開花率達到100%，并導致花序伸長。蕭元川研究了GA與BA對多花與單花組合形成的雜交品種（ ×Somers Isles）的影響，發(fā)現(xiàn)125 mmol/L GA可明顯促進開花，BA在開花起始階段與GA產(chǎn)生拮抗作用，但對花序發(fā)育則具有協(xié)同作用，并提出GA可能通過改變植物碳水化合物的代謝與分配從而促進開花的啟動。

綜上所述，由于兜蘭花發(fā)育進程時間長，難以明確其關(guān)鍵發(fā)育時間節(jié)點，需進一步明確兜蘭花芽分化的解剖顯微過程，探索影響兜蘭花芽分化的關(guān)鍵激素。目前可以確定赤霉素可以促進兜蘭提前開花，但其作用機制有待進一步探討。

?營養(yǎng)調(diào)控

陳影研究了不同比例氮、磷、鉀含量的花肥和植物生長調(diào)節(jié)劑處理對魔帝兜蘭（Maudiae）花期的影響，結(jié)果表明噴施花多多2號高磷肥和花多多11號高鉀肥能促進開花，施肥處理對魔帝兜蘭花朵形態(tài)無顯著影響。Wathanasakun- ek研究了不同的栽培基質(zhì)與鈣肥對兜蘭開花的影響，結(jié)果表明樹皮混合水苔以及顆粒海綿（granulate sponge）的組合栽培基質(zhì)在促進花朵數(shù)量方面明顯優(yōu)于單一的樹皮栽培基質(zhì)，另外300?mmol/L鈣肥處理后產(chǎn)生較多花朵。

分子生物學研究進展

近年來，組學技術(shù)的迅速發(fā)展大大推動了蘭科植物開花相關(guān)分子機制的研究。目前已有7個蘭科植物種類完成了全基因組測序，分別是深圳擬蘭（）鐵皮石斛（， ）鼓槌石斛（）、小蘭嶼蝴蝶蘭（）、香子蘭（）和墨蘭（Cymbidium sinense）。另外，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以全面快速地獲取特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。目前，借助二代測序技術(shù)，對蘭科植物開展了大量的轉(zhuǎn)錄組學研究。通過比較轉(zhuǎn)錄組分析，篩選差異表達基因，有助于更好地了解復雜開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進一步深入挖掘蘭科植物開花相關(guān)特異性關(guān)鍵基因提供重要參考。通常情況下，對于石斛屬植物，低溫與細胞分裂素均能誘導其開花。為探究春化和細胞分裂素信號通路在開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系，Wen等通過比較轉(zhuǎn)錄組研究了對照組、冷處理組和細胞分裂素處理組間的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)低溫促進細胞分裂素信號通路上關(guān)鍵基因的表達，且低溫與細胞分裂素處理均能觸發(fā)（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）（LEAFY）（APETALA1）和赤霉素信號通路關(guān)鍵基因顯著上調(diào)，說明低溫、細胞分裂素和赤霉素信號通路相互作用共同調(diào)控石斛屬植物開花。低溫同樣能促進蝴蝶蘭屬植物開花，Huang等對低溫和高溫處理的蝴蝶蘭植物腋芽的轉(zhuǎn)錄組進行了分析和比較，發(fā)現(xiàn)低溫誘導赤霉素合成基因的表達，說明在低溫條件下，赤霉素通路可能也在蝴蝶蘭花期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。與石斛和蝴蝶蘭相反，文心蘭屬（）植物通常在高溫（30℃）條件下完成成花轉(zhuǎn)變。通過比較轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫環(huán)境下，氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡可能是誘導文心蘭在高溫環(huán)境下開花的內(nèi)源性信號之一。因此，不同的蘭科植物進化出與其生長環(huán)境相關(guān)的特異性花期調(diào)控機制，多種花期調(diào)控信號通路相互作用共同調(diào)控植物完成成花轉(zhuǎn)變。同時，越來越多與蘭科植物開花相關(guān)的關(guān)鍵開花基因被挖掘，Wang等綜述了近年來國內(nèi)外對蘭花開花基因的研究進展。

兜蘭屬植物由于其材料自身的局限性，其開花相關(guān)分子機制研究進展較慢。王燕君等利用SMART策略構(gòu)建了硬葉兜蘭花芽的抑制性消減雜交（SSH）文庫，得到了18條差異表達片段，通過序列比對，發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因含有多個轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的同源基因，可能參與硬葉兜蘭的花發(fā)育調(diào)控過程。李冬梅等從同色兜蘭中分離了花器官發(fā)育相關(guān)的2個MADS-box基因和。通過氨基酸序列比對、蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化樹分析表明，和分別屬于B類MADS-box蛋白家族的AP3和PⅠ亞家族。表達分析顯示，和在花芽發(fā)育中均有表達，在成熟花、唇瓣和花瓣中的表達量高，在蕊柱、萼片、苞葉和根中次之，在花莖和葉中較低，在子房中幾乎不表達;在各組織中均有不同豐度的表達。通過二代測序技術(shù)，已對杏黃兜蘭的成熟花芽進行測序，能為兜蘭的分子生物學提供信息。然而，僅從一個物種和一個發(fā)育階段獲得花芽的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是遠遠不夠的。因此，來自不同種類和發(fā)育階段的花芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將有助于獲得更全面的數(shù)據(jù)資源和深入了解兜蘭的開花機制。LI等利用高通量測序技術(shù)對同色兜蘭、硬葉兜蘭和2個常見的栽培品種‘紅魔帝’（ Red Maudiae）和‘綠魔帝’（Green Maudiae）的混合花芽分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，在對高溫途徑相關(guān)基因進行同源序列分析時發(fā)現(xiàn)基因只存于高溫下開花的兜蘭中，推測在部分兜蘭中基因?qū)ο?秋開花型兜蘭有正向調(diào)節(jié)作用。另外和可能是調(diào)節(jié)兜蘭成花（大小和結(jié)構(gòu)）和開花時間的關(guān)鍵基因。

鎖定關(guān)鍵開花基因后，需要對其進行功能驗證。與模式植物擬南芥不同，蘭科植物為單子葉植物，具有基因組大、轉(zhuǎn)化效率低、再生周期長、生長緩慢的特點。因此，常通過在擬南芥、水稻或煙草中異源表達相關(guān)基因的方式間接驗證基因的功能。另外，病毒誘導的基因沉默及轉(zhuǎn)基因技術(shù)是通過反向遺傳學的方式研究蘭花基因功能的有效途徑。目前在重要商品蘭花，如蝴蝶蘭與石斛中形成了較為成熟的功能基因驗證方法。Hsieh等報道了一種利用大花蕙蘭花葉病毒（CymMV）作為沉默載體，通過農(nóng)桿菌侵染花序或葉片，誘導蝴蝶蘭基因沉默的優(yōu)化方法，并成功沉默和等基因，誘導顯著的表型，其沉默效率高達95.8%。隨后，Jang等運用該方法成功驗證了敲除蝴蝶蘭植株的表型。組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，將有助于蘭花基因的功能研究和具有商業(yè)價值性狀的蘭花基因工程。由于蝴蝶蘭與石斛均具備了成熟的組培再生體系，借助組織培養(yǎng)技術(shù)，Hsing等以蝴蝶蘭原球莖為受體材料，優(yōu)化了一種高效可遺傳的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了大約1.2%～5.2%的轉(zhuǎn)化率。CHAI等以石斛愈傷組織為受體材料，利用L-methionine sulfoximine（MSO）作為選擇劑，優(yōu)化了一種高效的基因槍介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系。該體系已成功應(yīng)用于過表達轉(zhuǎn)基因石斛蘭品系的建立。

然而，相較于蝴蝶蘭與石斛屬植物，兜蘭屬植物開花相關(guān)基因的研究起步較晚，遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟。近年來，兜蘭屬植物非共生萌發(fā)離體快繁技術(shù)體系不斷取得新的突破，為建立兜蘭屬植物遺傳轉(zhuǎn)化奠定了一定基礎(chǔ)。一些兜蘭種子在經(jīng)非共生萌發(fā)產(chǎn)生原球莖后，通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調(diào)控可以通過原球莖誘導出愈傷組織或類原球莖完成再生過程，通過成熟的愈傷組織或類原球莖再生體系進行遺傳轉(zhuǎn)化。張莉以魔帝兜蘭的原球莖為受體材料，利用農(nóng)桿菌子房注射法、農(nóng)桿菌介導法和基因槍法對魔帝兜蘭遺傳轉(zhuǎn)化進行了初步探究。研究發(fā)現(xiàn)利用農(nóng)桿菌子房注射法轉(zhuǎn)化魔帝兜蘭的最佳注射時間為授粉后48～53 d，證實最佳注射時間為魔帝兜蘭的受精時間。在農(nóng)桿菌介導法中，對原球莖進行針刺處理可以最大限度地獲得抗性受體材料，抗性受體材料的獲得率高達4.17%;用農(nóng)桿菌侵染液侵染受體材料20 min時獲得率最高，為5.00%;侵染后受體材料最合適的共培養(yǎng)時間為3 d，其獲得率為4.17%;在共培養(yǎng)基內(nèi)添加200 μmol/L AS的轉(zhuǎn)化效率為5.83%，均高于其他濃度的轉(zhuǎn)化率。另外在基因槍介導法中發(fā)現(xiàn)，在基因槍轟擊前對受體材料進行甘露醇高滲處理，含0.3 mmol/L甘露醇的高滲培養(yǎng)基的獲得率高達6.67%;利用直徑為0.6?μm的金粉在9?cm的轟擊距離下進行轟擊的獲得率最佳;轟擊后的受體材料在恢復培養(yǎng)基下培養(yǎng)20 d后再進行篩選培養(yǎng)的獲得率最高。LUO等通過激光共聚焦顯微鏡對魔帝兜蘭的胚胎發(fā)育過程進行了顯微觀察，發(fā)現(xiàn)其在受粉后40～45 d是受精期，在此期間進行子房注射能獲得較高的轉(zhuǎn)化率，最高可達2.54%。為了更好地了解兜蘭屬植物基因的功能，加速兜蘭分子育種研究，需要繼續(xù)探索適合兜蘭屬植物更可靠、更穩(wěn)定、更高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

近年來，新的分子工具不斷涌現(xiàn)，為植物定向分子育種提供了強有力的技術(shù)保障。通常，兜蘭屬等多年生植物通過傳統(tǒng)雜交育種的方式獲得多個優(yōu)良性狀集于一體的雜交組合的效率較低。基因編輯技術(shù)如CRISPR-Cas9為獲得非模式生物的無效突變體（null mutation）和多點突變體（multiple mutant）提供了一個便捷的工具。這一技術(shù)的出現(xiàn)不僅有助于蘭花分子遺傳學研究，而且有助于通過靶向基因編輯產(chǎn)生具有各種優(yōu)良性狀的新型蘭花品種。目前，在小蘭嶼蝴蝶蘭中，已成功利用CRISPR/Cas9獲得了MADS基因（、和）的多點突變體，三重突變率高達97.9%。同時還獲得了單突變體和雙突變體以了解不同基因突變對花發(fā)育的影響。今后，借助新型分子技術(shù)的發(fā)展，兜蘭屬植物的基因編輯技術(shù)也將日漸成熟，花期調(diào)控研究也將更加深入和全面。另外，近些年表觀遺傳（DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA、染色質(zhì)重塑）與開花途徑間的機理研究越來越深入，尤其是表觀調(diào)控在春化途徑（vernalization pathway）和年齡途徑（age pathway）中發(fā)揮著重要作用。是春化途徑調(diào)控擬南芥開花的關(guān)鍵調(diào)控因子，春化對表達抑制的維持主要是通過與位點結(jié)合的非編碼RNA（和）的表達和基因上組蛋白修飾來實現(xiàn)的，其中植物多梳蛋白抑制復合體（polycomb repressive complex2， PRC2）以及PRC1-like復合物起著重要作用。年齡途徑中短鏈（20～24個核苷酸）非編碼RNA（micRNA）miR156、miR172及其靶基因SPLs組成年齡途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，確保植物在非誘導條件下開花。兜蘭屬植物為無限的總狀花序，外界環(huán)境因素極大地影響其開花數(shù)量與花朵品質(zhì)。如單花的麻栗坡兜蘭（）和杏黃兜蘭（）在適宜的環(huán)境條件下甚至能開出3～4朵花。表觀遺傳調(diào)控極有可能參與其成花誘導，影響其開花。目前尚未發(fā)現(xiàn)通過表觀遺傳修飾調(diào)控兜蘭花期的研究。在其他觀賞植物如菊花、杜鵑花和矮牽牛中均發(fā)現(xiàn)，使用DNA甲基化抑制劑處理植株后，花期提前。說明去甲基化能調(diào)控開花基因的表達，促進提前開花。因此，在兜蘭屬植物中可以嘗試進一步探究表觀遺傳修飾模式如DNA甲基化水平、組蛋白修飾的類型和非編碼RNA的種類的改變對其開花的影響。

問題與展望

綜上所述，兜蘭屬植物花期調(diào)控研究進展較為緩慢主要原因有以下幾點：（1）材料自身的局限性。由于兜蘭在自然界繁殖難度大，難以獲得足夠數(shù)量的原生種用于研究，特別是兜蘭屬所有野生種類均被列入CITES的附錄I后更不可能獲得;其次，利用無菌播種生產(chǎn)出的原生種實生苗從出瓶到開花，一般需要2～6 a時間，生長周期長，同時，由于其抗性較差，較少應(yīng)用于商品化規(guī)模生產(chǎn)。（2）種間差異大，開花習性多樣。例如，在自然光照和溫度下進行溫室栽培，同色兜蘭一年四季都能開花，而帶葉兜蘭只能在4—5月開花。我國華南地區(qū)栽培的兩大流行品種‘紅魔帝’和‘綠魔帝’一年四季開花，但其遺傳背景不一致，不是理想的花期調(diào)控研究材料。（3）缺乏參考基因組序列信息。借助轉(zhuǎn)錄組研究，雖然能加快探究兜蘭開花分子機制的步伐，但由于缺乏參考基因組，采用從頭組裝的方式進行組裝的序列信息，注釋較差，大部分序列不具有全長cDNA特征，因此后期進行基因功能研究難度較大。（4）尚未建立成熟的組織培養(yǎng)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。由于兜蘭雜交種具有豐富的花型、花色和較好抗性等雜種優(yōu)勢，目前市場上銷售的兜蘭多為雜交種，但采用雜交種為親本的同一雜交組合的實生苗，個體生長習性具有巨大的差異，花期也不一致，如魔帝類兜蘭的雜交后代，不但花色變化極大，花期也極不一致，大部分組合的雜交后代一年四季均可開花，因此在開展花期試驗時難以獲得足夠數(shù)量遺傳背景一致的材料用于花期調(diào)控研究。

針對上述問題，利用組織培養(yǎng)建立兜蘭快繁體系獲得足夠數(shù)量且品質(zhì)均一的組培苗是花期調(diào)控研究的關(guān)鍵，華南植物園在兜蘭屬植物組織培養(yǎng)方面取得了較好的進展，已成功建立了魔帝類兜蘭組織培養(yǎng)技術(shù)體系并生產(chǎn)出大量的試管苗，可用于花期調(diào)控研究。另外，近年來隨著第3代測序技術(shù)的成熟和成本的大幅降低，借助太平洋生物科學公司（Pacific Biosciences， Pac Bio）的單分子實時（single-molecule real-time， SMRT）測序技術(shù)或牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies， ONT）的單分子納米孔測序技術(shù)，采用三代聯(lián)合二代的測序策略，可以獲得具有更高可信度的差異表達分析和數(shù)據(jù)發(fā)掘結(jié)果，有效彌補了二代測序技術(shù)出現(xiàn)的大部分序列不具有全長cDNA特征的缺點，有助于功能基因的克隆和功能驗證，也能更有效地開展兜蘭花期調(diào)控等相關(guān)分子機制研究。

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