劉茂宇, 楊藝輝, 王金華*, 師健友

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,四川 成都 611100； 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所,北京 100050; 3. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 藥學(xué)部,四川 成都 610072)

癌癥這類非傳染性、慢性疾病現(xiàn)已是造成人類死亡的主要原因之一。癌癥的產(chǎn)生是一個(gè)多因子、多步驟的復(fù)雜過程,具有細(xì)胞分化、增殖異常、生長(zhǎng)失控和轉(zhuǎn)移性等生物學(xué)特征。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),在2018年間約有960萬人死亡,約占全球死亡人數(shù)的六分之一。人們對(duì)于抗腫瘤藥的需求逐年上漲,市場(chǎng)上的抗腫瘤新藥也不斷出現(xiàn),目前最為常見的抗癌藥物有化療藥物、中藥、生物制藥、靶向藥物等,尋求一種治療效果好,毒副作用低的藥物尤為重要[1]。

天然產(chǎn)物因其作為多靶點(diǎn),多層次,多方位調(diào)節(jié)的毒性較小的藥物從眾多靶點(diǎn)單一,毒副作用強(qiáng)的傳統(tǒng)藥物中脫穎而出[2]。我國已對(duì)幾千種植物藥進(jìn)行過活性篩選,發(fā)現(xiàn)多種植物藥中的活性成分具有良好抗癌效果,如喜樹堿[3]、紫杉醇[4]、苦參堿[5]、乳香酸[6]等。乳香是一種橄欖科植物卡氏乳香樹BoswelliacarterliBirdw.及同屬數(shù)種植物BoswelliabhaurdajianaBirdw.皮部滲出的油膠樹脂,乳香中的主要成分為樹脂、樹膠和揮發(fā)油,其中樹脂含量最多(60%～70%),樹脂主要成分為游離α,β-乳香脂酸、結(jié)合乳香脂酸、蒎烯、二戊烯、α,3-水芹烯等成分,其中最主要的有效成分為五環(huán)三萜類化合物,主要可分為齊墩果烷型、烏蘇烷型和羽扇豆烷型,另外,樹脂中還含有部分四環(huán)三萜類化合物[7]。乳香酸(boswellic acid)是乳香中的主要活性成分,屬五環(huán)三萜類化合物,研究表明,乳香中的三萜具有細(xì)胞毒性和抗腫瘤特性[8]。

3-O-乙酰-11-酮基-β-乳香酸(AKBA)是一種具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的三萜酸,是乳香酸中活性最強(qiáng)的化合物之一,能抑制關(guān)鍵炎癥介質(zhì)5-脂氧合酶(5-LOX)發(fā)揮抗炎抗氧化作用,并且能通過抑制VEGFR2和mTOR信號(hào)通路有效抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)[9-11]。AKBA具有幾個(gè)關(guān)鍵的生物活性功能單元,包括C-3位的乙酰氧基、C-24位的羧基和C-11位的酮基,許多新的AKBA衍生物正是從這些藥效團(tuán)出發(fā)進(jìn)行進(jìn)一步的設(shè)計(jì)和合成的[12-14]。與天然存在的AKBA相比,在C-3上用酰胺基取代酸和氮的boswellic acid類似物具有更高的選擇性抑制5-LOX和增加細(xì)胞毒性的潛力[10]。Phillip Krüger團(tuán)隊(duì)研究了AKBA的滲透性,在研究限制乳香酸生物利用度的因素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)即使AKBA是一個(gè)親油的化合物,其滲透性卻很差,導(dǎo)致其生物利用度低[15],這可能正是AKBA細(xì)胞毒性低的主要原因。研究表明,C-24位酰胺基的存在有望提高細(xì)胞毒性[10,14,16-17]。

因此我們計(jì)劃在C-24位引入一系列氨基化合物以合成AKBA酰胺類衍生物,期望得到具有更高細(xì)胞毒性的AKBA衍生物。以AKBA為原料,在氯化亞砜既作溶劑,又作反應(yīng)物的條件下,得到氯取代的AKBA中間體,然后加入氨基化合物進(jìn)行取代反應(yīng),最后得到高產(chǎn)率的AKBA酰胺類衍生物S137、S151、S179、S184、S443、S634、S677、S673(Scheme 1),總收率為88%～96%,其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和MS(ESI)表征。并采用了CCK8法測(cè)試了這8個(gè)化合物對(duì)人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)、人肺癌細(xì)胞(A549)的體外抗腫瘤活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AMX 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 1260 Infinity II型高效液相色譜儀；Q-TOF Premier高分辨質(zhì)譜儀；Thermo CO2培養(yǎng)箱；Kylin-Bell Lab instruments微型超聲振蕩器；MD M5型酶標(biāo)儀。

AKBA,北京藥物研究所王金華老師提供；環(huán)戊胺、N-異丙基乙二胺、4-氨基四氫吡喃、2-氨甲基吡啶、2-(2-氨乙基)吡啶、(1-甲基-4-哌啶)甲胺、N-(2-氨基乙基)嗎啉、炔丙胺,Adamas試劑公司；氯化亞砜,安耐吉化學(xué)；CCK-8,碧云天生技術(shù)公司；其余所用試劑均為分析純,科隆化學(xué)品有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,Corning。

1.2 AKBA酰胺類衍生物的合成(以S151為例)

將AKBA(20 mg, 1 eq.)溶于過量氯化亞砜中(0.5 mL>1 eq.),在30 ℃下攪拌1 h,點(diǎn)板監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。由于酰氯不穩(wěn)定,點(diǎn)板時(shí)需將酰氯轉(zhuǎn)換成甲酯,吸取30 μL甲醇于2 mL離心管中,再吸取10 μL反應(yīng)液緩慢滴加于甲醇中(反應(yīng)放熱),最后加入1 mL水,用少量乙酸乙酯進(jìn)行萃取,取上層點(diǎn)板。反應(yīng)完畢后將反應(yīng)瓶直接進(jìn)行旋蒸,由于氯化亞砜沸點(diǎn)較高,不容易除盡,在旋蒸時(shí)可少量多次加入沸點(diǎn)低的二氯甲烷溶液,以更好的除去氯化亞砜。最后得到透明貼壁的固體,烘干后得到白色的氯代AKBA中間體粉末19.68 mg,收率95%。

Scheme 1

將旋蒸得到的中間體(19.68 mg,1 eq.)溶于適量1 mL二氯甲烷溶液中,加入N-異丙基乙二胺(6 mg,1.5 eq.),在30 ℃下進(jìn)行攪拌反應(yīng)1 h,點(diǎn)板監(jiān)測(cè)反應(yīng)至完成。反應(yīng)完畢后,向反應(yīng)液中加入8倍量的水,用少量乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取,萃取完后用飽和食鹽水洗乙酸乙酯層,再用無水硫酸鈉對(duì)乙酸乙酯層進(jìn)行除水操作。最后將有機(jī)層旋干,薄層色譜(二氯甲烷/甲醇=30/1,V/V)純化得白色粉末狀固體32.12 mg,收率92%,即為化合物S151。

用類似的方法合成化合物S137、S179、S184、S443、S634、S667和S673。

S137： 深黃色固體,收率62%,含量66.20%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.76(d,J=7.1 Hz, 1H), 5.43(s, 1H), 5.11(s, 1H), 3.49～3.41(m, 1H), 2.33(s, 1H), 2.27(d,J=14.2 Hz, 1H), 2.11～2.05(m, 1H), 2.02(s, 3H), 1.86(s, 2H), 1.83(s, 2H), 1.71(d,J=18.9 Hz, 4H), 1.67(s, 1H), 1.63(s, 3H), 1.56(s, 1H), 1.54(s, 2H), 1.51(t,J=3.1 Hz, 2H), 1.48(s, 1H), 1.30(s, 6H), 1.23(s, 2H), 1.21(s, 1H), 1.18(s, 1H), 1.14(s, 1H), 1.09(s, 3H), 1.05(s, 3H), 0.99(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C37H57NO4Na{[M+Na]+}602.4288, found 602.4177。

S151： 白色固體,收率92%,含量58.65%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.09(t,J=5.7 Hz, 1H), 5.43(s, 1H), 5.11(d,J=2.8 Hz, 1H), 3.24(d,J=7.0 Hz, 2H), 3.02(dd,J= 12.8 Hz, 6.1 Hz, 1H), 2.69(p,J=6.1 Hz, 1H), 2.57(t,J=6.2 Hz, 2H), 2.30～2.22(m, 1H), 2.09(td,J=13.5 Hz, 4.6 Hz, 1H), 2.02(s, 3H), 1.87～1.75(m, 2H), 1.68(d,J=9.5 Hz, 2H), 1.55(d,J=11.0 Hz, 1H), 1.49～1.36(m, 6H), 1.30(s, 5H), 1.26(d,J=8.0 Hz, 1H), 1.22(d,J=4.4 Hz, 2H), 1.18(d,J=4.1 Hz, 1H), 1.14(d,J=6.2 Hz, 1H), 1.11(d,J=5.5 Hz, 3H), 1.04(s, 3H), 1.00(s, 3H), 0.96(d,J=2.9 Hz, 3H), 0.95(d,J=2.9 Hz, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: calcd for C37H61N2O4{[M+H]+}597.4553, found 597.4623。

S179： 白色固體,收率96%,含量78.55%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.87(d,J=7.8 Hz, 1H), 5.43(s, 1H), 5.11(s, 1H), 3.82(d,J=11.0 Hz, 4H), 3.25(s, 1H), 2.37(s, 2H), 2.33(s, 1H), 2.28(d,J=14.6 Hz, 1H), 2.09(q,J=15.8 Hz, 13.1 Hz, 2H), 2.03(s, 3H), 1.98(s, 1H), 1.84(d,J=12.7 Hz, 2H), 1.65(d,J=12.6 Hz, 2H), 1.53(s, 1H), 1.41(d,J=13.2 Hz, 6H), 1.30(s, 5H), 1.24(d,J=9.3 Hz, 3H), 1.18(s, 1H), 1.12(d,J=6.5 Hz, 1H), 1.09(s, 3H), 1.05(s, 3H), 1.00(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.3 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C37H57NO5Na{[M+Na]+}618.4237, found 618.4185。

S184： 白色固體,收率93%,含量70.54%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.47(d,J=4.7 Hz, 1H), 7.82(s, 1H), 7.73(t,J=6.8 Hz, 1H), 7.24(dd,J=15.1 Hz, 7.6 Hz, 2H), 5.42(s, 1H), 5.14(s, 1H), 4.43(dd,J=15.6 Hz, 5.7 Hz, 1H), 4.30(dd,J=15.8 Hz, 5.3 Hz, 1H), 2.36(s, 1H), 2.29(d,J=15.7 Hz, 1H), 2.14～2.05(m, 1H), 2.03(s, 3H), 1.82(s, 2H), 1.75(d,J=12.4 Hz, 1H), 1.68(d,J=13.4 Hz, 1H), 1.54(d,J=10.9 Hz, 1H), 1.43(t,J=14.1 Hz, 6H), 1.30(s, 5H), 1.23(s, 5H), 1.13(s, 3H), 1.07(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.83(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C38H54N2O4Na{[M+Na]+}625.4084, found 625.3973。

S443： 白色固體,收率88%,含量76.44%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.48(d,J=5.0 Hz, 1H), 7.69(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.26(d,J=7.7 Hz, 1H), 7.20(t,J=6.0 Hz, 2H), 5.42(s, 1H), 5.10(s, 1H), 2.91(t,J=6.8 Hz, 4H), 2.67(s, 1H), 2.29(s, 1H), 2.09(s, 1H), 2.02(s, 3H), 1.54(d,J=11.4 Hz, 2H), 1.46(d,J=9.6 Hz, 3H), 1.40(s, 2H), 1.38～1.31(m, 4H), 1.29(s, 5H), 1.24(s, 5H), 1.02(s, 3H), 0.98(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.83(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.3 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C39H56N2O4Na{[M+Na]+}639.4240, found 639.4133。

S634： 白色固體,收率93%,含量65.16%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.21(s, 1H), 5.44(s, 1H), 5.11(s, 1H), 3.03～2.95(m, 1H), 2.89～2.80(m, 1H), 2.71(d,J=10.9 Hz, 2H), 2.37(s, 1H), 2.26(d,J=14.2 Hz, 1H), 2.10(s, 3H), 2.03(s, 3H), 1.80(d,J=13.8 Hz, 2H), 1.73(d,J=11.0 Hz, 2H), 1.61(d,J=15.7 Hz, 2H), 1.55(d,J=11.2 Hz, 3H), 1.49～1.36(m, 6H), 1.30(s, 5H), 1.25(d,J=9.7 Hz, 3H), 1.19(s, 1H), 1.14(s, 1H), 1.11(s, 1H), 1.08(s, 3H), 1.04(s, 3H), 0.99～0.96(m, 3H), 0.92(s, 3H), 0.79(s, 3H), 0.75(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C39H63N2O4{[M+H]+}623.4710, found 623.4858。

S667： 黃色固體,收率85%,含量54.09%;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.60(s, 1H), 6.96(s, 1H), 5.44(s, 1H), 5.12(d,J=3.0 Hz, 1H), 3.59(t,J=4.7 Hz, 2H), 3.55(t,J=4.7 Hz, 4H), 2.91(t,J=6.2 Hz, 1H), 2.46(d,J=6.1 Hz, 1H), 2.39(d,J=6.8 Hz, 5H), 2.33(s, 1H), 2.15～2.05(m, 1H), 2.03(s, 3H), 1.83(dd,J=15.7 Hz, 11.2 Hz, 2H), 1.75(d,J=14.8 Hz, 1H), 1.72～1.67(m, 1H), 1.55(d,J=10.9 Hz, 1H), 1.43(d,J=10.2 Hz, 6H), 1.31(s, 5H), 1.23(s, 2H), 1.19(s, 1H), 1.13(s, 3H), 1.04(s, 3H), 1.02(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.80(s, 3H), 0.76(d,J=6.2 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF) m/z: calcd for C38H60N2O5Na{[M+Na]+}647.4502, found 647.4395。

S673： 白色固體,收率94%,含量83.74%;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 7.57(t,J=5.6 Hz, 1H), 5.39(s, 1H), 5.06(d,J=2.8 Hz, 1H), 3.89(ddd,J=17.1 Hz, 5.9 Hz, 2.5 Hz, 2H), 3.68(ddd,J=17.1 Hz, 5.3 Hz, 2.5 Hz, 2H), 2.59(s, 1H), 2.55(s, 1H), 2.23(d,J=14.3 Hz, 1H), 2.05(td,J=13.5 Hz, 4.8 Hz, 1H), 1.99(s, 3H), 1.80(dd,J=13.7 Hz, 5.0 Hz, 1H), 1.73(d,J=12.7 Hz, 1H), 1.64(d,J=13.0 Hz, 1H), 1.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 1.51(d,J=11.1 Hz, 1H), 1.44～1.33(m, 6H), 1.26(d,J=4.0 Hz, 5H), 1.22(d,J=7.8 Hz, 1H), 1.19(d,J=5.3 Hz, 1H), 1.18～1.16(m, 1H), 1.16～1.13(m, 1H), 1.12～1.07(m, 1H), 1.05(s, 3H), 0.99(s, 3H), 0.94(s, 3H), 0.88(s, 3H), 0.75(s, 3H), 0.71(d,J=6.4 Hz, 3H); HR-MS(ESI-TOF) m/z: calcd for C35H52NO4{[M+H]+}550.3818, found 550.3900。

1.3 抗癌活性測(cè)試

采用CCK8法測(cè)試化合物S137、S151、S179、S184、S443、S634、S667、S673和AKBA對(duì)人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)的細(xì)胞增殖抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,HL-60和HCT116選擇1640培養(yǎng)基,A549選擇DMEM培養(yǎng)基,將細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作后,待細(xì)胞長(zhǎng)到良好的形態(tài)時(shí),將細(xì)胞用胰酶消化下來,進(jìn)行離心,混合均勻,計(jì)數(shù),以每孔3000個(gè)細(xì)胞/100 μL接種于96孔板中,置于5%CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 24 h后,加入不同濃度梯度(終濃度為30 μM、 10 μM、 3 μM、 1 μM、 0.3 μM、 0.1 μM)的S151、S179、S184、S443、S634和AKBA各100 μL,含HCT116細(xì)胞和A549細(xì)胞的孔板，含孵育72 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入含有無血清培養(yǎng)基稀釋的 CCK8溶液(1/10稀釋)100 μL,含HL-60細(xì)胞的孔板孵育72 h后，每孔加入CCK8溶液20 mL，于37 ℃孵育0.5～2 h,孵育后可觀測(cè)到孔板內(nèi)培養(yǎng)基變?yōu)椴煌疃鹊某壬?用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值。根據(jù)相對(duì)細(xì)胞增殖抑制率和藥物濃度,由軟件GraphPad Prism計(jì)算得出半效抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗癌活性

表1為化合物的體外抗腫瘤活性。由表1可知,這8個(gè)AKBA酰胺類衍生物中S137、S151、S179、S634、S677、S673的抗癌活性都有不同程度的增加,尤其是化合物S137、S151和S634,其中S137對(duì)HL-60和A549的抑制效果較好,IC50分別為1.781和1.763 μM,優(yōu)于AKBA(IC50=16.160 μM和10.900 μM),S151對(duì)HL-60抑制效果最好,IC50為1.255 μM,優(yōu)于AKBA(IC50=16.160 μM),S634對(duì)HCT116的抑制效果最好,IC50為1.193 μM,優(yōu)于AKBA(IC50=13.020 μM)。有研究表明酰胺基取代酸的boswellic acid衍生物具有更高的細(xì)胞毒性,且在癌癥治療中發(fā)揮凋亡作用[18],我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果印證了對(duì)AKBA進(jìn)行酰胺取代后,細(xì)胞毒性有所增強(qiáng)。

表1 化合物的體外抗腫瘤活性

2.2 構(gòu)效關(guān)系

被動(dòng)擴(kuò)散是大多數(shù)藥物的主要擴(kuò)散機(jī)制,AKBA酰胺類衍生物進(jìn)入到癌細(xì)胞內(nèi)來發(fā)揮抑癌作用,需要通過細(xì)胞膜這個(gè)屏障。細(xì)胞膜主要是由磷脂雙分子層的基本骨架構(gòu)成的,外層是親水的極性頭部集團(tuán),內(nèi)層是疏水性脂肪鏈,藥物通過被動(dòng)擴(kuò)散的方式通過細(xì)胞膜時(shí),藥物分子周圍的水和分子首先脫落,氫鍵斷裂,然后藥物通過磷脂分子的極性頭部集團(tuán),再通過脂肪連親脂區(qū)域,脂溶性較強(qiáng)的化合物更容易通過磷脂雙分子層膜的內(nèi)部區(qū)域[19]。AKBA通過結(jié)構(gòu)改造成酰胺類化合物后脂溶性增強(qiáng),從結(jié)果可以看出,化合物的脂溶性增強(qiáng),細(xì)胞毒性也不同程度的加強(qiáng)。

通過比較S184、S634和其他衍生物,可看出AKBA酰胺衍生物中取代基為脂肪胺的化合物活性優(yōu)于取代基為芳胺的化合物。通過比較S184、S634、S667和其他衍生物,可看出AKBA酰胺衍生物中取代基為飽和胺的化合物活性優(yōu)于不飽和胺的化合物。再通過比較S137、S151、S179、S634和S667,可看出AKBA酰胺衍生物中氨基取代基不含氧的化合物活性優(yōu)于氨基取代基中含氧的化合物,且氨基取代基中含有多余氮的化合物活性優(yōu)于氨基取代基中未含有多余氮的化合物。

合成了8個(gè)AKBA酰胺類衍生物,通過抗腫瘤細(xì)胞增殖測(cè)試最終得到活性較好的化合物S137,S151和S634。其中S137對(duì)HL-60和A549的抑制效果較好(IC50分別為1.781和1.763 μM),其活性是分別是AKBA(IC50=16.160和10.900 μM)的9.07倍和6.18倍,S151抑制HL-60效果最好(IC50=1.255 μM),其活性是AKBA(IC50=16.160 μM)的12.88倍,S634抑制HCT116效果最好(IC50=1.193 μM),其活性是AKBA(IC50=13.020 μM)的10.91倍,結(jié)果顯示對(duì)于AKBA的結(jié)構(gòu)優(yōu)化是有用的,且取代基為含氮脂肪胺的AKBA衍生物活性最好,能夠顯著提高化合物的細(xì)胞毒性。