丁李春

（寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建福安 355003）

黑牛肝菌［Phlebopus portentosud（Berk.&Broome）Boedijn.］，又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，隸屬擔(dān)子菌門（Basi diomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、牛肝菌目（Boletales）、小牛肝菌科（Boletinellaceae）、脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）[1]，目前普遍認(rèn)為牛肝菌是一類與宿主樹根系共生形成外生菌根的真菌類群，迄今為止，絕大多數(shù)種類尚未見人工栽培形成子實(shí)體的報(bào)道[2]，僅有黑牛肝菌實(shí)現(xiàn)了人工栽培， 栽培菌株均從野生菌分離馴化而來，且種性退化快，必須不斷篩選新菌株，并掌握其生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)及培養(yǎng)條件。 本試驗(yàn)從碳源、氮源、溫度、pH、無機(jī)鹽、含水量等6個(gè)因素對(duì)黑牛肝菌新菌株Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究，為其高效栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

黑牛肝菌菌株Np0193 系寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所通過對(duì)野生黑牛肝菌組織分離篩選所得。

1.2 供試培養(yǎng)基

培養(yǎng)基1:葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂 16 g，復(fù)合維生素 B 20 mg，水 1 000 mL；培養(yǎng)基2：發(fā)酵木屑70% ，玉米粉20%，豆粕8%，庶糖1%，石膏1%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 碳源試驗(yàn) 以不加葡萄糖的培養(yǎng)基1 為對(duì)照，分別用等量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖代替培養(yǎng)基1 中的葡萄糖作碳源， 觀測(cè)不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.2 氮源試驗(yàn) 以不加蛋白胨的培養(yǎng)基1 為對(duì)照，分別用牛肉膏、酵母膏、乙酸銨、尿素代替培養(yǎng)基1 中的蛋白胨作氮源， 觀測(cè)不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.3 溫度試驗(yàn) 以培養(yǎng)基1 為菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，設(shè)置 24℃、26℃、28℃、30℃、32℃ 5個(gè)溫度梯度，觀測(cè)不同溫度對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

1.3.4 pH 試驗(yàn) 以培養(yǎng)基1 為菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，設(shè)置 pH 為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 6個(gè)梯度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（用 1 mol/L NaOH 和 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH，使用pH 計(jì)進(jìn)行 pH 測(cè)量）[3]，觀測(cè)不同 pH 對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.5 無機(jī)鹽試驗(yàn) 以培養(yǎng)基1 中不加無機(jī)鹽為對(duì)照，分別用等量的硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化鉀、氯化鈉、碳酸鈣代替培養(yǎng)基1 中的磷酸二氫鉀，觀測(cè)不同無機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.6 培養(yǎng)料含水量試驗(yàn) 將培養(yǎng)基2 的含水量調(diào)節(jié)至50%、55%、60%、65%、70%、75%分別裝入25 mm×200 mm 試管中, 每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù),0.147 MPa 滅菌2.5 h，接種后于28℃恒溫培養(yǎng),觀測(cè)不同含水量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.4 接種培養(yǎng)

碳源試驗(yàn)、氮源試驗(yàn)、無機(jī)鹽試驗(yàn)、pH 試驗(yàn)均于平板中央接種1 塊直徑6.5 mm 活化的菌絲塊，于28℃下恒溫培養(yǎng)， 溫度試驗(yàn)則在設(shè)定的恒溫下培養(yǎng)，定期（7 d、10 d、13 d）用十字交叉法[4]測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性檢測(cè)用Excel 2007 和SPSS 17 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響

從表1 可以看出， 以可溶性淀粉為碳源黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)整齊、菌落完整，生長(zhǎng)速度最快為2.92 mm/d，與對(duì)照差異顯著；以蔗糖、麥芽糖、果糖為碳源黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)不整齊， 生長(zhǎng)速度分別為 2.41 mm/d、2.35 mm/d、2.32 mm/d， 與對(duì)照差異顯著， 菌絲生長(zhǎng)7～10 d 后顏色開始變成褐色并伴有深褐色分泌物產(chǎn)生，菌絲老化快。

表1 不同碳源對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.2 不同氮源對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響

從表2 可以看出， 在培養(yǎng)基1 中分別添加1 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、乙酸銨、尿素，與對(duì)照相比其菌絲的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于未加氮源的培養(yǎng)基1。其中以蛋白胨、酵母膏為氮源的菌絲生長(zhǎng)快且最為健壯，邊緣整齊， 顏色呈黃色， 生長(zhǎng)速度分別為2.56 mm/d和2.50 mm/d， 與其他各處理菌絲生長(zhǎng)速度相比差異顯著，說明蛋白胨是黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源，其次是酵母膏。 在培養(yǎng)基1 中添加1 g/L 尿素作氮源，培養(yǎng)20 d 菌絲仍未生長(zhǎng)，說明尿素添加量在一定范圍內(nèi)對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用， 這與何明霞等[5]在氮源篩選時(shí)尿素抑制菌絲生長(zhǎng)的結(jié)論相一致。

表2 不同氮源對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.3 不同溫度對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響

從表3 可以看出，溫度對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)作用十分明顯， 在24～32℃溫度下菌絲均能生長(zhǎng)，30℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快， 達(dá)到 2.61 mm/d，到32℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度下降， 菌絲前端生長(zhǎng)不整齊，菌絲顏色變深且易老化，接種塊處形成深褐色液狀分泌物；在24℃溫度下菌絲生長(zhǎng)速度最慢，為1.51 mm/d。本試驗(yàn)中黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為28～30℃，這與羅順珍等[6]適宜黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基及主要環(huán)境條件試驗(yàn)中得出的黑牛肝菌菌絲適宜生長(zhǎng)溫度為27～31℃的結(jié)論基本一致。

表3 不同溫度對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 pH 對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響

pH 是影響黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的主要因素之一。 從表4 可以看出，黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)適宜pH 為 4.5～5.5，最適為4.5，菌絲生長(zhǎng)速度最快為2.72 mm/d，且菌絲濃密，黃色先端整齊；pH 低于4.0 或高于5.5 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌絲索狀前端生長(zhǎng)不整齊，易形成褐色菌核。

表4 不同pH 對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.5 無機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響

從表5 可以看出， 添加7種無機(jī)鹽均對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用，且易出現(xiàn)菌絲老化、菌落褐色，菌絲生長(zhǎng)速度均比對(duì)照慢， 但添加碳酸鈣時(shí)菌絲生長(zhǎng)整齊且比對(duì)照菌絲粗壯。 加入氯化鈉時(shí)對(duì)菌絲的抑制作用最為顯著，生長(zhǎng)速度為1.5 mm/d，與對(duì)照差異顯著。 添加1 g/L 無機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)影響較大， 不同無機(jī)鹽添加量對(duì)其生長(zhǎng)的影響有待進(jìn)一步研究。

表5 不同無機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.6 培養(yǎng)料含水量對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響

從表6 可以看出，黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)適宜含水量為55%～65%，最適為60%；低于50%或高于70%時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢、菌絲稀疏、抗逆性差，菌絲索狀前端生長(zhǎng)不整齊。

表6 不同含水量對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

黑牛肝菌是新興的優(yōu)質(zhì)珍稀食用菌， 其菌絲生長(zhǎng)關(guān)鍵因素、 遺傳育種和高產(chǎn)栽培技術(shù)等方面的研究在我國(guó)的報(bào)道尚不多見[7]。 目前黑牛肝菌人工栽培的菌株是從野生菌分離馴化而來，且種性退化快，必須不斷篩選新菌株， 并掌握其生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)及培養(yǎng)條件。本試驗(yàn)從碳源、氮源、溫度、pH、無機(jī)鹽、含水量等6個(gè)因素對(duì)黑牛肝菌新菌株Np0193 菌絲生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了研究，為其高效栽培提供理論基礎(chǔ)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，黑牛肝菌新菌株Np0193 菌絲生長(zhǎng)最適碳源是可溶性淀粉， 菌絲生長(zhǎng)整齊、 菌落完整，生長(zhǎng)速度為2.92 mm/d；適宜氮源為蛋白胨、酵母膏，菌絲生長(zhǎng)快且健壯，邊緣整齊，顏色呈黃色，生長(zhǎng)速度分別為2.56 mm/d 和2.50 mm/d； 溫度對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)作用十分明顯，在24～32℃溫度下菌絲均能生長(zhǎng)，最適溫度為28～30℃，30℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，達(dá)到 2.61 mm/d；適宜 pH 為 4.5～5.5，最適為4.5，菌絲生長(zhǎng)速度最快為2.72 mm/d，且菌絲濃密，黃色先端整齊，常規(guī)PDA 培養(yǎng)基pH 6.0 左右不適合黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)； 添加1 g/L 無機(jī)鹽均對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用，且易出現(xiàn)菌絲老化、菌落褐色，菌絲生長(zhǎng)速度均比對(duì)照慢，降低無機(jī)鹽的添加量是否對(duì)其菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用還有待于進(jìn)一步研究；適宜含水量為55%～65%，最適為60%，低于50%或高于70%時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢、菌絲稀疏、抗逆性差。

液體菌種在生產(chǎn)上的應(yīng)用是食用菌工廠化生產(chǎn)的必然趨勢(shì)[8]。 黑牛肝菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求及培養(yǎng)條件的要求比較嚴(yán)格，菌種在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，縮短菌種培養(yǎng)時(shí)間迫在眉睫。 本試驗(yàn)對(duì)黑牛肝菌Np0193 菌絲生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及關(guān)鍵條件進(jìn)行了研究，為其液體菌種的開發(fā)提供了依據(jù)。