馬藝沔 陳 晗 陳 娟 張 艷 常洪雷 王 馳 張 爭

（1.中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所 北京 100193；2.北京萊萬生物技術有限公司 北京 101116；3.北京中潤佳創(chuàng)科技發(fā)展有限公司 北京 100071）

靈芝是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，性味甘平，久服無毒，益血安神，可以治療虛勞、失眠、冠心病、肝炎等多種疾病。 《中國藥典》中收錄靈芝中赤芝［Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.］和紫芝［Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang］2個品種[1]。 其中，紫芝多作保健用，赤芝多作藥用。 現(xiàn)代醫(yī)學表明，赤芝中富含多糖與三萜類藥效物質，具有重要的藥理活性[2]。 我國適宜栽培靈芝的地區(qū)較多，隨著近年來赤芝人工栽培技術的不斷發(fā)展， 赤芝的栽培面積與產量不斷擴大[3]。然而，當前赤芝藥材市場混亂，質量參差不齊。 傳統(tǒng)評價赤芝藥材好壞的依據主要通過赤芝外觀特征，以菌蓋大小與菌柄長短區(qū)分赤芝等級， 僅有商品性狀而缺乏科學依據。 另一方面，赤芝屬中高溫型藥用真菌，生長過程中極易受到真菌侵染，而赤芝藥材侵染的真菌種類還不清楚。 針對這一系列情況，建立了靈敏有效的赤芝藥效成分含量測定方法和真菌鑒定方法， 初步比較和評價了不同地區(qū)赤芝的藥效成分含量差異及真菌侵染情況， 為靈芝的栽培育種和質量標準制定提供了依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用靈芝材料除少量樣品為市場購買外， 大部分為本文作者采集。 所采集和購買的16 份靈芝藥材包括栽培赤芝和露天仿野生栽培靈芝，來自福建、安徽、北京等9個省市，重點采集北京地區(qū)栽培靈芝。經由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所陳向東副研究員鑒定，均為靈芝屬赤芝。

1.2 試驗方法

1.2.1 赤芝樣品的水溶性浸出物含量測定 依據《中國藥典》水溶性浸出物測定法（通則2201）項下的熱浸提法進行赤芝樣品的水溶性浸出物含量測定[1]。

1.2.2 赤芝樣品的總多糖含量測定 采用藥典記載的硫酸蒽酮法測定赤芝樣品的總多糖含量[4]。 操作過程：精確稱取赤芝子實體粉1 g 通過水提醇沉法提取獲得共5 mL 赤芝總多糖溶液。 向50 mL 離心管中加入無水乙醇至47.5 mL 刻度線，4℃靜置12 h 后離心后棄上清， 將離心管開蓋水浴蒸干， 得到赤芝粗多糖。 配制120 μg/mL 的無水葡萄糖對照品溶液，精密量 取 對 照 品 溶 液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置具塞試管中，補水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密量取蒽酮0.1 g，加硫酸 100 mL 使之溶解， 搖勻）6 mL， 立即搖勻放置15 min，冰浴15 min 后取出，以相應試劑為空白，在625 nm 波長處測定吸光度值。以吸光度為橫坐標、濃度為縱坐標，繪制標準曲線。 根據標準葡萄糖溶液得出的標準曲線計算回歸方程為Y=0.001 2X-0.001 3，R2=0.999 3，線性范圍 0～735 μg/mL。將赤芝多糖溶解于5 mL 蒸餾水，稀釋至合適濃度，按標準曲線制備項下方法測定吸光度值。 再通過標準曲線方程計算赤芝多糖含量。

1.2.3 赤芝樣品的總三萜與甾醇含量測定 采用香草醛—冰醋酸—高氯酸比色法測定赤芝樣品的總三萜與甾醇的含量[5-6]。 具體方法：精密稱量干燥的赤芝子實體2 g 于150 mL 錐形瓶中， 用移液管精密加入40 mL 乙醇， 密封超聲20 min 后搖勻抽濾， 收集濾液，藥渣再次精密加40 mL 乙醇超聲20 min，收集合并2 次濾液， 將濾液38℃真空干燥， 定容于5 mL HPLC 級甲醇。 配制0.2 mg/mL 的齊墩果酸對照品溶液， 精密量取對照品溶液 0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、 0.5 mL， 分別置于具塞試管中揮干， 放冷，精密加入0.2 mL 新配置的香草醛—冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g， 加冰醋酸10 mL 溶解即得）、高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在546 nm 波長處測定吸光度， 以吸光度為縱坐標、 濃度為橫坐標繪制標準曲線。 計算回歸方程為Y=0.06X-0.002 5，R2=0.993 3，線性范圍0～12 μg/mL。 精密量取濃縮的乙醇提取物20~30 μL 于具塞試管內，揮干放冷，精密加入新配置的香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴加熱15 min， 立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應試劑為空白，在546 nm 波長處測定吸光度，通過標準曲線方程計算得到樣品中總三萜與甾醇的含量。

1.2.4 赤芝樣品污染真菌的分離與鑒定 赤芝樣品在袋中混勻后，稱取樣品3 g，放入已有27 mL 無菌水的錐形瓶中，置于25℃搖床，設置轉速為150 r/min，振蕩時間為30 min。 振蕩30 min 后的懸濁液即為10-1 的懸液。 另取裝有9 mL 無菌水的離心管1 支，標記為10-2。 取振蕩后靜止30 s 的梯度為10-1 的懸液， 用無菌移液槍頭吸取1 mL 懸液加入標記為10-2 的無菌水離心管中，在離心管中吹吸數次混勻，之后在渦旋混合器振蕩30 s， 使之充分混勻而成為濃度梯度為10-2 的稀釋液。 選擇10-1 和10-2 懸液，用無菌移液槍頭吸取100 μL，分別注入到含抗生素的 MEA、DG18、DRYES、AFPA（9 cm）培養(yǎng)基平板中， 每種培養(yǎng)基設3個重復， 用無菌玻璃珠涂布均勻，每個平板加入5~6 顆無菌玻璃珠。 涂布后晾干的平板倒置放在25℃條件下培養(yǎng)4~7 d，待平板上長出明顯的菌落后，選擇適當的稀釋度進行計數。 計數之后用無菌牙簽挑取平板中不同菌落形態(tài)的少許菌苔，采用三點法接入MEA 或DG18（6 cm）培養(yǎng)基平板中。 從DG18 分離的菌株用DG18 純化，用其他培養(yǎng)基分離得到的菌株用MEA 純化，直到獲得純培養(yǎng)菌株。 用記號筆在平板底部寫樣品編號、重復、序號（此為菌株原始編號）、分離培養(yǎng)基及日期。 挑完菌后用封口膜將平板封好口，倒置于25℃黑暗培養(yǎng)4～7 d。鑒定主要以菌落、菌體形態(tài)觀察等為依據。 鑒定完的真菌加入甘油管于-80℃冰箱保存。

1.2.5 菌株分子鑒定 樣品提交中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所鑒定中心進行分子鑒定。采用rDNA-ITS序 列 分 析 ， 所 應 用 的 引 物 為 ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′， 由上海生工生物工程股份有限公司進行引物合成， 由金唯智公司進行擴增產物的測序， 測序結果通過美國國立信息中心網站進行BLAST 比對分析。 查看比對結果， 與污染菌擴增rDNA-ITS 序列具有99~100 相似度的序列所對應的物種，就認為是該污染菌對應的物種。

1.2.6 赤芝樣品黃曲霉毒素含量的測定 取赤芝藥材粉末7.5 g， 置于50 mL 離心管中， 加入氯化鈉1.5 g，精密加入70%甲醇37.5 mL，充分混勻，置于搖床中轉速 230 r/min，2 h， 再 4 000 r/min 離心 5 min，精密量取上清液7.5 mL， 置于25 mL 容量瓶中用水稀釋至刻度，搖勻，再次4 000 r/min 離心10 min，精密量取上清液20 mL，通過親和免疫柱作為供試品溶液。 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2，用甲醇稀釋至 20 ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、5 ng/mL。采用HPLC 光化學衍生法:光化學衍生器（254 nm），熒光檢測器檢測， 激發(fā)波長λex=360 nm， 發(fā)射波長λem=450 nm。 流動相：水—甲醇和乙腈，體積比（30.4~48.0）∶21.6，流速 1.2 mL/min，檢測時間 35 min，柱溫30℃，進樣量 10 μL。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)赤芝藥效成分的比較

共收集來源于福建、浙江、山東、北京等產區(qū)的赤芝品種16 份，經形態(tài)鑒定，赤芝樣品菌蓋木栓質、半圓形或腎形，寬12～20 cm，厚約2 cm。 皮殼堅硬，初黃色，漸變成紅褐色，有光澤，均為藥典收錄赤芝品種，也是最常見的赤芝栽培品種。 根據藥典方法測定了16 份赤芝樣品的水溶性浸出物含量。 采用硫酸蒽酮法測定了赤芝樣品的總多糖含量。 采用硫酸蒽酮法測定赤芝樣品的總多糖含量。 采用香草醛—冰醋酸—高氯酸比色法測定了總三萜與甾醇含量。 測定結果見表1。藥典規(guī)定赤芝藥材水溶性浸出物含量應達到3.0%。所測試的赤芝樣品中，赤芝水溶性浸出物含量為4.20%～11.70%，所測赤芝樣品水溶性浸出物含量均合格。 其中，又以北京市通州區(qū)的赤芝樣品BJ13 和BJ14 為最高， 以浙江赤芝樣品ZJ3 為最低?？傮w來看， 大部分北京市赤芝樣品的水溶性浸出物含量要高于其他地區(qū)。 藥典規(guī)定赤芝藥材總多糖含量應達到0.9%。 測試結果表明，14 份樣品總多糖含量達標，在0.90%~3.11%之間，北京市房山區(qū)赤芝樣品BJ9 和山東聊城赤芝樣品SD4 的總多糖未達標。而湖北黃岡英山縣的赤芝樣品AH10 與北京通州區(qū)的樣品BJ14 多糖含量為最高。 藥典規(guī)定赤芝藥材總三萜和甾醇含量應達到0.5%。 測試結果表明， 僅有13 份樣品達標， 達標樣品中， 以北京市通州區(qū)樣品BJ12 的三萜含量為最高。綜合來看，北京市通州區(qū)的赤芝樣品BJ12 和BJ14，以及湖北黃岡英山縣的赤芝樣品質量要優(yōu)于其他樣品。 由本次測試結果可以看出，北京通州地區(qū)較為適宜赤芝栽培，選用優(yōu)良菌種和栽培方式，可以培養(yǎng)出具有較高藥效物質含量的赤芝樣品。

表1 赤芝樣品16 份的藥典指標含量測定數據（單位：%）

2.2 赤芝樣品污染菌類群分析

采用 4種培養(yǎng)基即 MEA、DG18、DRYES 及 AFPA對赤芝藥材樣品進行了污染菌的分離， 均分離到污染菌，部分污染菌分離情況見圖1。 根據污染菌的形態(tài)對污染菌進行初步鑒別， 并對分離到的污染菌進行低溫保存。 對樣品污染菌進行計數，由表2 可知，來自北京市房山區(qū)的赤芝BJ4 樣品上污染菌數最高（2 667~4 500 CFU/g 污染菌）， 來自北京市房山區(qū)的赤芝BJ9 樣品上污染菌數也高達2 333~3 000 CFU/g污染菌，其他來自于福建、浙江、安徽、湖北、山東、山西、黑龍江、四川的赤芝樣品污染菌數均較低（低于300 CFU/g）。 來自北京房山區(qū) 1 份赤芝樣品 BJ10 和來自北京市通州區(qū)的3 份赤芝樣品沒有檢測到污染菌。 采用不同培養(yǎng)基的污染菌分離結果和分離得到的污染菌數大體一致， 說明4種培養(yǎng)基均能對赤芝樣品中的污染菌進行很好的分離。

圖1 部分污染菌分離培養(yǎng)平板

表2 赤芝樣品污染菌分離情況

根據菌株分子鑒定的結果， 對不同樣品中污染菌的分離頻率進行了計數，結果表明，在所有樣品中曲霉屬（Aspergillus）真菌均是優(yōu)勢菌。 分離得到的曲霉屬物種有 Aspergillus calidoustus、Aspergillus niger、Aspergillus sydowii 等。 此外，青霉素（Penicillium）和藍狀菌屬（Talaromyces）也是分離頻率較高的屬。對應用AFPA 培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下分離的污染真菌進行了分離頻率分析， 曲霉屬污染真菌包括A. brasiliensis、A.calidoustus、 A.cvjetkovicii、 A.hiratsukae、 A.niger、A.proliferans、 A.versicolor 等， 青霉素污染真菌包括Penicillium chrysogenum、 P. citrinum、 P. commune、P. griseofulvum、 P. steckii， 藍狀菌屬真菌包括 Talaromyces cellulolyticus 和 T. radicus， 其他物種包括Cladosporium cladosporioides、 Coprinellus velatopruinatus、 Coprinus fissolanatus、Cryptococcus flavescens、Naganishia albida、 Rhodotorula mucilaginosa、 Trichoderma longibrachiatum 等， 各種污染真菌分離頻率見表3?？梢姡糠莩嘀悠芬话阄廴?~3種優(yōu)勢真菌，污染的真菌種類都不相同，以曲霉屬和青霉素真菌為主。

表3 赤芝樣品中污染真菌的分離頻率 (單位：%)

2.3 赤芝藥材樣品中黃曲霉毒素測定結果

對能夠分離出污染菌的12 份赤芝樣品中的黃曲霉毒素含量進行了檢測。 檢測結果（圖2）顯示，12 份樣品中3 份樣品檢測出黃曲霉毒素B1峰， 經計算黃曲霉毒素含量均低于《中國藥典》通則2351 真菌毒素測定中對黃曲霉毒素的規(guī)定檢出限度0.5 μg/kg，1 份疑似陽性樣品。 其中，檢測出黃曲霉毒素B1峰的樣品分別為來源于福建廈門（FJ1）、浙江麗水龍泉縣（ZJ2）、山東聊城（SD4）的樣品，一份疑似出現(xiàn)黃曲霉毒素B1峰的樣品為來源于浙江（ZJ3）的樣品。

圖2 赤芝樣品（12 份）黃曲霉毒素檢測HPLC

3 結論與討論

本研究對來自北京、 福建、 安徽等9個地區(qū)的16 份赤芝樣品的藥效成分進行了測試。 根據中國藥典的檢測指標，所測試的赤芝樣品中，所有赤芝水溶性浸出物含量均合格，14 份樣品總多糖含量達標，但僅有13 份樣品的三萜與甾醇含量達標。 說明在赤芝藥效成分中， 三萜和甾醇含量是限制赤芝質量的一個重要標準。 在赤芝栽培過程中，需要注意栽培技術的提高，滿足赤芝的生長周期和特性，以提高赤芝質量。 本次測試的16 分樣品中，綜合來看，北京市通州區(qū)的赤芝樣品BJ12 和BJ14 質量要優(yōu)于其他樣品。可以看出， 北京通州地區(qū)可以培養(yǎng)出具有較高藥效物質含量的赤芝樣品， 特別是總三萜和甾醇含量較高的產品。 赤芝三萜類化合物種類豐富，其中的靈芝酸類化合物已有大量研究報道證實具有多種藥理作用。 《美國藥典》中對赤芝藥材的成分測定指標為多糖與靈芝酸2 類。 對不同地區(qū)赤芝藥材中的靈芝酸類成分進一步通過HPLC 法一測多評，能夠更為全面地評價靈芝藥材質量。 另一方面，本次檢測的樣本數量僅有16個，樣本量還較少。 增加樣本量并采用多種測試與統(tǒng)計方法， 才能夠對赤芝的質量與等級作出更為全面的評價。

中藥材受真菌污染乃至霉變現(xiàn)象時有發(fā)生，嚴重影響了中藥材的質量和安全。 本研究通過對來自9個地區(qū)的12 份赤芝藥材進行黃曲霉毒素及污染真菌的分析， 對供試樣品中外源毒素及真菌污染情況進行初步的研究。 通過對供試赤芝藥材上污染菌的分析發(fā)現(xiàn)，總體來說，赤芝藥材上污染菌數較低，產黃曲霉毒素的黃曲霉及寄生曲霉均未分離到， 也沒有檢測到黃曲霉系列毒素。 從污染菌的類群來說，以曲霉屬、青霉屬、籃狀菌屬為主要的污染菌。 本研究中采用了4種培養(yǎng)基對污染菌進行了分析，4種培養(yǎng)基分離的菌數，類群基本情況類似，說明這4種培養(yǎng)基都能很好地作為污染菌的分離培養(yǎng)基。 相比較其他3種培養(yǎng)基，AFPA 培養(yǎng)基作為一種選擇性分離黃曲霉和寄生曲霉的培養(yǎng)基， 可以更高效地判斷樣品中是否有這2種產毒菌株的存在[7]。 雖然大部分報道中黃曲霉和寄生曲霉是產生黃曲霉毒素的主要菌株，但是隨著研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)目前產黃曲霉毒素的菌株已經擴展到14個種[8]，說明黃曲霉毒素的污染對于赤芝及其他中藥材都具有較大的安全隱患，需要在整個種植、采收、儲存及銷售過程中注意監(jiān)控產毒真菌的污染水平，保障赤芝藥材的安全性。通過HPLC 檢測未發(fā)現(xiàn)供試赤芝藥材樣品中有黃曲霉系列毒素超限的情況，說明赤芝藥材外源黃曲霉毒素污染水平較低， 但本研究測定的12 份赤芝藥材樣品對于整個中藥材市場來說只是冰山一角，代表性稍顯不足，因此要想獲得全面的污染情況來更好地對國內市場的赤芝藥材進行安全評價，還需要后續(xù)更充分的檢測。