劉 凱，李瑤玲，李 洋，王紅霞，趙書(shū)崗，安秀紅，張志華

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 山區(qū)研究所/河北省農(nóng)業(yè)工程中心/國(guó)家北方山區(qū)工程中心，河北 保定 071001；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；4.河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，河北 保定 071001）

核桃（Juglans regiaL.）是世界著名的“四大堅(jiān)果”之一，栽培歷史悠久，是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，但非生物脅迫嚴(yán)重影響著核桃正常的生長(zhǎng)發(fā)育［1］。冷適應(yīng)蛋白(cold-regulated, COR)基因家族是植物中所特有家族，包括COR6、COR15A、COR47、COR413等成員，COR413首次在擬南芥響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中發(fā)現(xiàn)［2］。該家族根據(jù)定位不同分為2 個(gè)亞組，分別是定位于細(xì)胞膜（PM）和類(lèi)囊體膜蛋白（TM）［3］。有多項(xiàng)研究表明，COR413基因受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并且參與到響應(yīng)低溫過(guò)程中［4-6］。目前COR413基因在響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中的角色逐漸清晰，先后在擬南芥［7］、山葡萄［3］、丹參［8］、油菜［9］、小立碗蘚［10］等多種植物中發(fā)現(xiàn)COR413基因家族成員。王鵬洋等指出油菜FmCOR413［11］基因表達(dá)的節(jié)律性與低溫耐受性相關(guān)聯(lián)，在夜晚與低溫情況下表達(dá)量顯著升高。丁小玲等［3］研究表明山葡萄4 個(gè)COR413s家族成員基因有不同程度的響應(yīng)低溫脅迫。多項(xiàng)研究表明COR413 基因家族成員廣泛參與到植物響應(yīng)冷脅迫中，但在核桃中對(duì)COR413 基因家族進(jìn)行鑒定和分析尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于最新核桃基因組中鑒定JrCOR413 基因家族成員，并對(duì)其進(jìn)行綜合分析，并分析其家族成員在冷脅迫與不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，為解析核桃JrCOR413 基因家族成員在響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料核桃(Juglans regiaL.)為同一株實(shí)生砧木上同時(shí)嫁接‘遼8’和‘清香’，2 年生苗。整株進(jìn)行冷脅迫（0.5 ℃）處理48 h，未低溫處理為對(duì)照。采集葉片液氮速凍。不同組織（根、嫩莖、嫩葉、雄花、雌花、老葉）均采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園‘清香’核桃，采集后液氮速凍，送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNA-Seq 測(cè)序，3 次重復(fù)。

JrCOR5表達(dá)分析為盆栽2 年生‘清香’核桃。整株進(jìn)行冷脅迫處理4、8、12、24、36、48 h，采集后液氮速凍，用于RNA 提取并反轉(zhuǎn)錄為模板，進(jìn)行qPCR 表達(dá)分析（試劑來(lái)源天根生化有限公司，貨號(hào)DP441、KP108-01、FP205）。

1.2 核桃JrCOR413 基因家族分析

擬南芥JrCOR413 家族成員序列來(lái)自于uniport（https://www.uniprot.org/）蛋白序列，利用生物信息方法［12］于核桃參考基因組GCF_001411555.2中挖掘鑒定JrCOR413。利用PFAM 蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）分析保守結(jié)構(gòu)域，利用在線(xiàn)分析工具Gene Structure Display Server 2.0（http://gsds.gao-lab.org/） 和Multiple Em for Motif Elicitation（http://meme-suite.org/） 對(duì) 核 桃JrCOR413 家族基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析。利用MEGA X 軟件構(gòu)建核桃和擬南芥COR413 家族成員的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，方法為Neighbour-Joining，Bootstrap 值為1 000。

1.3 核桃JrCOR413 基因的生物信息學(xué)分析

分別利用NCBI 上的ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/orffnder/)、ExPASy (https://web. expasy.org/ protparam/)、NetPhos 3.1 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、Net NGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）、Plantcare（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析家族成員的開(kāi)放閱讀框、蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化和磷酸化位點(diǎn)、3D 結(jié)構(gòu)及啟動(dòng)子順式結(jié)合元件。

1.4 核桃JrCOR 413 家族基因表達(dá)分析

將‘清香’冷處理4、8、12、24、36、48 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，以 FPKM 為基因表達(dá)量衡量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行表達(dá)分析［13］。對(duì)‘清香’的雌花、根、老葉、嫩莖、嫩葉、雄花、芽進(jìn)行RNA-seq 分析不同組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，以 FPKM 為基因表達(dá)量衡量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行表達(dá)分析。JrCOR5 表達(dá)分析于NCBI 上檢索基因序列信息，并利用pick primer 在線(xiàn)設(shè)計(jì)引物（表1）。反應(yīng)程序：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，1 min；4 ℃，holding。qPCR 反 應(yīng) 體 系（20 μL）： 含12.5 μL SYBR MIX、1.0 μL cDNA 模板、1.0 μL F Primer、1.0μL R Primer、4.5 μL ddH2O；反應(yīng)體系：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 min；72 ℃，1 min；4 ℃，holding。試驗(yàn)結(jié)果用 2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃JrCOR413 家族成員挖掘與分析

2.1.1 核桃JrCOR413 家族成員染色體定位與基因信息分析 將AtCOR413 家族7 個(gè)蛋白序列運(yùn)用Hmmer 3.0 與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合等生物信息方法，并利用MEGA X 進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定出6 個(gè)核桃JrCOR413 家族基因（表2），編碼7 條完整的蛋白，分布在4 條染色體（圖1），并命名為JrCOR1 ～JrCOR7。在6 個(gè)JrCOR413s 中基因長(zhǎng)度最短的為1 790 bp，最長(zhǎng)的為7 447 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度在549 ～804 bp，翻譯得到的JrCOR413 蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度均處于182 ～267 個(gè)氨基酸之間，分子量在19.74 ～30.04 kD 之間；等電點(diǎn)在8.15 ～9.93之間，7 個(gè)蛋白均為堿性；利用ExPasy 進(jìn)行穩(wěn)定性預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，該家族成員均為穩(wěn)定蛋白。

表2 核桃JrCOR 家族成員的基因信息Table 2 Basic information of JrCOR gene family genes from J. regia

圖1 核桃 JrCOR 基因染色體定位Fig.1 Mapping of the JrCOR gene family on chromosomes in J. regia

利用ExPasy 將基因的疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)（表3），其成員平均疏水性均>0，屬于疏水性蛋白。利用Net NGlyc 1.01.0 和NetPhos 3.1Server 分 析 其 家 族成員磷酸化位點(diǎn)和糖基化（表3），7 個(gè)JrCOR413蛋白含有8 ～15 個(gè)絲氨酸，2 ～9 個(gè)蘇氨酸，2 ～3個(gè)酪氨酸；只有JrCOR2、JrCOR4、JrCOR6 含有1個(gè)N-糖基化，并且只有JrCOR4、JrCOR6 含有2 個(gè)O-糖基化。

表3 核桃JrCOR 家族蛋白的理化性質(zhì)Table 3 Basic information of JrCOR gene family from J. regia

2.1.2 核桃JrCOR413 家族多序列比對(duì)分析 利用DNAMAN 對(duì)核桃JrCOR413 家族7 個(gè)蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)并分析其保守結(jié)構(gòu)域（圖2），看出核桃7 個(gè)家族成員蛋白在10 ～208 aa 之間含有WCOR 結(jié)構(gòu)域，并且具備植物典型的COR413 結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)。

圖2 核桃JrCOR413 家族成員蛋白序列比對(duì)分析Fig.2 Multiple alignment of JrCOR413 family from J. regia

2.2 不同物種 JrCOR413 家族進(jìn)化樹(shù)分析

將核桃與擬南芥COR413 家族共14 個(gè)蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析（圖 3）。結(jié)果表明，核桃與擬南芥COR413 家族蛋白同源性較高，并且劃分為2 個(gè)亞組，一亞組COR413-PM 定位于細(xì)胞膜有5 個(gè)成員，另一個(gè)亞組 COR413- TM 定位于類(lèi)囊體膜有2 個(gè)。

圖3 JrCOR413 與AtCOR413 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree of JrCOR413 and AtCOR413

2.3 核桃JrCOR413 家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序與3D 結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步研究核桃JrCOR413 基因進(jìn)化，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)與保守基序進(jìn)行分析（圖4）。結(jié)果表明，核桃JrCOR413 家族成員都包含由4 ～6 個(gè)外顯子不等，亞組1 中5 個(gè)成員均含有4 個(gè)外顯子，亞組2 含均有5 個(gè)內(nèi)含子；核桃JrCOR413 存在相同的保守基序motif 1 與motif 2；在相同亞組成員蛋白序列中保守基序分布具有極高的相似度，亞組2 中2個(gè)蛋白含有特有的保守基序motif 5。通過(guò)SWISSMODEL 進(jìn)行該基因家族蛋白3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖5），結(jié)果表明7 個(gè)蛋白成員呈現(xiàn)不同的3D 結(jié)構(gòu)。

圖4 核桃JrCOR413 家族成員基因結(jié)構(gòu)與保守基序Fig.4 Gene structure and Conserved motif analysis of JrCOR413 family from J. regia

圖5 核桃JrCOR413 家族成員蛋白3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 3D structure prediction of JrCOR413 family

2.4 核桃JrCOR413 家族基因啟動(dòng)子元件分析

利用Plantcare 對(duì)核桃JrCOR413 基因家族成員起始密碼子上游1 800 bp 啟動(dòng)子區(qū)作用元件進(jìn)行分析（圖6），核桃JrCOR413 基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)激素（水楊酸、茉莉酸、乙烯、赤霉素等）信號(hào)和響應(yīng)脅迫（干旱、低溫、應(yīng)激和防御等）調(diào)控元件，并且含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（bHLH TFs：G-box，MYB TFs：MYB binding site 等）結(jié)合元件，特別是JrCOR3 和JrCOR7 含有LTR 元件，因此推測(cè)該成員與核桃響應(yīng)低溫脅迫相關(guān)。

圖6 核桃JrJrCOR 啟動(dòng)子區(qū)元件分布Fig.6 Elements in the promoter region of JrCOR genes

2.5 核桃JrCOR413 基因家族成員表達(dá)分析

將同一砧木嫁接‘遼寧8 號(hào)’和‘清香’，進(jìn)行0.5 ℃冷處理48 h 的RNA-seq 結(jié)果表明，核桃JrCOR413 家族7 個(gè)基因出現(xiàn)不同的響應(yīng)（圖7）。在12 個(gè)RNA 文庫(kù)中，只有JrCOR5同時(shí)出現(xiàn)了顯著上升的表達(dá)，其他基因變化不顯著。通過(guò)不同組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，JrCOR5在花器官和嫩莖中表達(dá)較高，特別是雄花表達(dá)最高；JrCOR7在雄花中表達(dá)較高。進(jìn)一步通過(guò)‘清香’冷處理4、8、12、24、36、48 h 后進(jìn)行qPCR 分析（圖8），發(fā)現(xiàn)冷脅迫4 h 出現(xiàn)顯著上升后下降，直至48 h 出現(xiàn)高峰，為對(duì)照90 倍左右，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)一致，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

圖7 核桃JrCOR 基因家族成員轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析熱圖Fig. 7 Heat map of JrCOR413 gene expression obtained from RNA-seq in Juglans regia L.

圖8 核桃JrCOR5 基因在冷脅迫不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)Fig. 8 Relative expression of JrCOR5 gene at different times of cold stress

3 結(jié)論與討論

COR 基因在植物響應(yīng)低溫脅迫中扮演著重要角色［14］。目前測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了植物的COR413的鑒定與分析，在山葡萄中發(fā)現(xiàn)4 個(gè)［3］，在甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)中分別鑒定到11、6 和6 個(gè)COR413 基因［9］等，本研究通過(guò)生物信息學(xué)于核桃最新基因組，挖掘并鑒定出6 個(gè)核桃COR413 家族基因，編碼7 條蛋白，并對(duì)其成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析，豐富了植物COR413 基因家族種類(lèi)，將為核桃COR413 基因解析響應(yīng)低溫脅迫分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

本研究首先對(duì)7 個(gè)COR413 家族成員蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，核桃7 個(gè)家族成員含有典型的WCOR413 高度保守的結(jié)構(gòu)域，可以看出符合COR413 家族類(lèi)型特點(diǎn)，與水曲柳［11］中FmCOR413 保守結(jié)構(gòu)域研究一致，而且王學(xué)娟［15］在山葡萄北冰紅冷適應(yīng)蛋白COR413-I2 也發(fā)現(xiàn)了WCOR413 高度保守的結(jié)構(gòu)域。

其次對(duì)鑒定的7 個(gè)COR413 家族成員的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)。核桃COR413家族成員都包含有4 ～6 個(gè)內(nèi)含子不等；核桃COR413 家族存在共同的motif 1 和motif 2，在2 個(gè)亞組內(nèi)具有極高的相似度；而且亞組2 中含有自己特有的保守基序，如motif 5，研究結(jié)果與山葡萄［3］COR413 蛋白保守基序分析結(jié)果研究一致。而且本研究對(duì)核桃與擬南芥COR413 家族共14 個(gè)蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，研究結(jié)果表明7 個(gè)核桃被分成TM 與PM 2 個(gè)亞組，在擬南芥［2］與山葡萄［3］4 個(gè)成員中也被分成了2 個(gè)亞組。本研究分析核桃6 個(gè)基因上游1 800 bp 啟動(dòng)子區(qū)域中存在的結(jié)合元件，6 個(gè)核桃COR413 啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)脅迫和激素響應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，并且含有低溫響應(yīng)元件，證實(shí)與響應(yīng)低溫脅迫有密切關(guān)系。

已有研究證實(shí)COR 基因能夠響應(yīng)低溫脅迫。金新開(kāi)等［16］研究表明AtCOR15a異源表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因番茄的耐寒性。林強(qiáng)等［17］為驗(yàn)證播娘蒿抗寒基因DsCOR的抗寒功能，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸染法終驗(yàn)證了抗寒基因DsCOR的抗寒功能，并且在山葡萄［3］、油菜［9］和水曲柳［11］中COR413基因能夠不同程度的響應(yīng)低溫脅迫。本研究通過(guò)將同一砧木嫁接‘遼寧8 號(hào)’和‘清香’，進(jìn)行0.5 ℃冷處理48 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)冷脅迫48 h，核桃JrCOR5轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，并通過(guò)qPCR 進(jìn)一步說(shuō)明了JrCOR5能夠響應(yīng)低溫脅迫。將為揭示核桃COR413 基因響應(yīng)冷脅迫機(jī)理奠定基礎(chǔ)。