趙小慧，王明臻，胡風慶*

(1.遼寧省經(jīng)濟作物研究所，遼寧 遼陽 111000；2.遼寧大學 輕型產(chǎn)業(yè)學院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanonate，PHA)是一種自然界存在的高分子材料，具有優(yōu)良的熱塑性、生物可降解性、生物相容性等性能[1-3].PHA在可降解包裝材料、醫(yī)藥緩釋材料、手性單體、組織工程材料、生物能源等方面有廣泛的應用前景[4-7].但PHA生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量低，還不能滿足各方面需求.PHA生產(chǎn)主要通過微生物發(fā)酵，已知300多種菌可合成PHA[8-9]，但僅有少數(shù)幾種可商業(yè)生產(chǎn)PHA.對于PHA合成，菌種和培養(yǎng)條件是2個重要影響因素[10]，優(yōu)良菌種可提高生產(chǎn)效率、降低成本[11]，培養(yǎng)條件之一的碳源占合成PHA成本的28%～50%，是制約PHA生產(chǎn)應用的瓶頸[12].不同碳源，可合成不同單體組成的PHA[13-14].利用混合碳源，能在一定程度上提高PHA產(chǎn)量，且可通過調整碳源比例獲得不同單體組成PHA，從而改變PHA理化性能，擴大PHA應用范圍[15-16].

生物柴油是解決日益緊缺能源問題的可行途徑，然而，在制備生物柴油過程中，會產(chǎn)生以甘油為主的大量副產(chǎn)物，造成環(huán)境污染[17-18].為促進生物柴油產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，避免環(huán)境污染，研究者探索利用副產(chǎn)物甘油合成PHA.但微生物菌株對高濃度甘油耐受性較差，多數(shù)情況下，菌株在高濃度甘油條件下無法合成PHA，更不能直接利用生物柴油副產(chǎn)物合成PHA[15-16，19-20].評估、篩選耐甘油PHA合成菌，優(yōu)化PHA生產(chǎn)條件，具有非常重要的理論和實際意義.

本研究以可合成PHA的食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)ZJ03和ZJ166，起皺假單胞菌(Pseudomonas.corrugata)CY06為出發(fā)菌株，評估篩選對甘油具有良好耐受性能的優(yōu)勢菌株，并優(yōu)化菌株利用甘油合成PHA條件.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

食油假單胞菌(P.oleovorans)ZJ03和ZJ166，起皺假單胞菌(P.corrugata)CY06.

1.2 主要實驗試劑與儀器

硫酸銨、甘油，沈陽禹王試劑公司；硫酸鎂，天津市博迪化工有限公司(AR).

DL-6M大容量冰凍離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；Agilent 7890A氣相色譜儀購自美國Agilent.

1.3 常用培養(yǎng)基的配置

LB培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基(礦物鹽培養(yǎng)基)：實驗中采用體積比將甘油添加到所配置培養(yǎng)基中，甘油含量以百分數(shù)表示[21].

1.4 方法

1.4.1 菌體培養(yǎng)

無菌條件下，實驗挑取LB平板上的菌株單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)8～12 h，制成種子液.5%接種至甘油含量分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，200 rpm培養(yǎng)72 h.

1.4.2 菌體干重

實驗將培養(yǎng)液8 000 rpm離心10 min收集菌體，分別用蒸餾水和95%乙醇洗菌體各1次，8 000 rpm離心10 min收集菌體，菌體稱重，冷凍干燥備用.

1.4.3 PHA含量測定及計算

實驗采用氣相色譜法測定PHA含量，按文獻[21]方法進行.

標樣質量=10 mg

2 結果

2.1 菌體干重

實驗測定P.oleovoransZJ03和ZJ166以及P.corrugataCY06在不同甘油含量下菌體干重(圖1).結果表明，ZJ03在甘油含量1%～5%時菌體干重隨甘油含量增加，5%～7%和9%～15%甘油含量時，菌體干重無明顯變化，9%時，菌體干重隨甘油含量增加而減少，在5%時最大，最大細胞干重為2.34 g/L.ZJ166在甘油含量為1%～3%時菌體干重下降，1%～9%時，菌體干重整體呈現(xiàn)上升趨勢，只在7%時，菌體干重減少，在甘油含量超過9%時，菌體干重下降.CY06菌體干重整體隨甘油含量增加而下降，在甘油含量為1%～5%時，菌體干重下降較快，而在甘油含量超過5%后，菌體干重變化不大.由此可見，在甘油含量較低時，3種菌株受影響較小，而在甘油含量大于7%后，ZJ03和CY06生長受到抑制，ZJ166菌株生長基本不受甘油含量影響，在較高含量也能很好生長，耐受甘油能力較強.

2.2 PHA含量

實驗將冷凍干燥菌體進行酯化處理之后，利用氣相色譜法測定菌體PHA，評估3種菌株的PHA合成能力(圖2).

圖1 3種假單胞菌在不同甘油含量下菌體干重

圖2 3種假單胞菌在不同甘油含量下PHA含量

結果表明，ZJ03在甘油含量為1%～9%時，PHA合成能力較高，在大于9%后，PHA合成能力急劇下降，維持在極低水平，在3%時達最高，PHA含量(質量分數(shù))為29.7%，在甘油含量為9%時，仍然能產(chǎn)生含量為23%的PHA.ZJ166無論在何種甘油含量下，PHA合成能力一直維持在極低水平上，PHA合成能力都較差.CY06在1%～3%的甘油含量時，PHA合成能力上升，3%～7%時，合成能力下降，在甘油含量大于7%后，PHA合成能力一直維持在較低水平.由此可見，ZJ03利用甘油合成PHA能力最強.

3 討論

根據(jù)菌體干重可知，3種菌株在不同甘油含量下生長狀況表現(xiàn)不同，表明耐受甘油能力不同.ZJ03和CY06在較高甘油含量下，生長均受到限制.ZJ166干重與甘油含量無明顯相關性，基本不受甘油含量影響.ZJ03的PHA合成能力明顯高于另2株菌.

菌體生長情況和PHA合成能力呈現(xiàn)一種偶聯(lián)關系.ZJ03的甘油耐受性較好，且該菌株利用甘油合成PHA能力最強，甘油含量1%～5%為該菌株合成PHA適宜濃度.隨著甘油含量增加，由于滲透壓作用，菌體生長受到抑制，導致細胞酶活性降低，PHA產(chǎn)量下降，還導致菌體生長速度減慢，細胞干重下降.這與文獻報道結果一致[15].

本研究結果表明，ZJ03能夠利用甘油合成PHA，這為解決生物柴油副產(chǎn)物帶來的環(huán)境污染拓展了新的解決方法.利用假單胞菌以甘油為原料生產(chǎn)PHA，不僅可降低環(huán)境污染風險，還可有效降低PHA生產(chǎn)成本，可有效促進可降解、可再生PHA的廣泛應用，為從根本上解決傳統(tǒng)塑料“白色污染”問題奠定基礎.